重金属汞离子免疫分析方法的研究

王玉珍，冯 锋，秦 君，白云峰，王海雁

(山西大同大学化学与化工学院，山西 大同 037009)

重金属汞离子免疫分析方法的研究

王玉珍，冯 锋*，秦 君，白云峰，王海雁

(山西大同大学化学与化工学院，山西 大同 037009)

快速定量检出环境及食品中的重金属离子已成为世界范围内的研究热点。免疫分析方法具有灵敏度高、特异性强、速度快、成本低、容易操作等优点，被广泛应用到环境和食品中重金属离子的检测中。本文主要介绍了重金属汞离子抗原制备过程中双功能试剂的选择、单克隆抗体的制备以及免疫分析方法的建立，并且就其与新型分析方法的结合趋势进行了探讨。

汞离子；免疫分析；单克隆抗体；双功能试剂

自然条件下，重金属一般以天然丰度广泛存在。但是，随着现代社会的不断发展，人们在工农业生产活动中对重金属的使用和接触越来越频繁，使得重金属对人类健康和自然环境产生了严重的不良影响。研究发现，摄入过量的重金属可以导致人体中毒，它能抑制人体酶的活性[1]，扰乱正常新陈代谢，引起心血管疾病，还能致畸[2]。重金属污染不可逆、广泛而隐蔽，且与多种污染物形成的复合物能规避常规检测方法。

汞是一种高污染、强毒性重金属，自然界的汞主要来源于海洋和火山喷发，但人类活动是汞污染的主要来源，如金矿冶炼、废物排放和燃料燃烧等。无机汞最稳定的状态是二价汞离子(Hg2+)，它会对人的神经系统、肾脏和内分泌系统造成很大的损伤；此外，河流和海洋中的微生物会使汞甲基化，形成甲基汞(CH3Hg+)，通过生物富集作用和食物链进入人体，严重影响人类健康。因此，建立能够快速定量检出环境及食品领域中痕量汞离子的方法具有重要意义。

传统检测汞离子的方法有分光光度法[3]，冷蒸气原子荧光光谱法[4-5]，氢化物发生原子荧光光谱法[6]，电感耦合等离子体发射光谱法[7]等。虽然这些方法可以准确测定分析物，但是样品预处理繁琐、仪器昂贵、测定时间长且无法用于现场检测。同上述方法相比，免疫分析方法具有灵敏、快速、简便、成本较低、特异性强和可以用于现场检测等优点，该方法是基于抗原抗体特异性结合的一种分析方法，已被广泛应用于环境监测、食品安全、生物医疗等方面。无论是大分子蛋白和小分子物质均可以用这种方法检测，如蛋白分子、杀虫剂、农药、兽药、重金属等[8-11]。

关于重金属离子的免疫检测模式刘功良[12]等做了详细报道，如荧光偏振免疫检测方法[13](一般用于多克隆抗体)，酶联免疫吸附分析方法，一步竞争性免疫检测法[14]，KinExA免疫检测法[15]等，而应用最多的是酶联免疫吸附分析方法。酶联免疫吸附分析方法主要包括抗原的制备、抗体的制备及分析方法的建立，本文主要对该方法的研究进展进行综述。

1 汞离子抗原的制备

1.1 常用汞离子抗原的制备方法

抗体的制备是建立免疫分析方法的基础，而抗体制备的关键是抗原的修饰，只有得到合理修饰的抗原，才能免疫动物产生优良的抗体。重金属离子本身分子量很小，没有免疫原性，无法直接对其进行修饰，所以重金属抗原的制备非常关键。目前，常用的方法是选择一种合适的双功能螯合剂，既能与蛋白连接，又可以与重金属离子形成螯合物，从而被动物免疫系统识别。常用的双功能螯合剂如图1(a-e)所示[16-17]，分别是乙二胺四乙酸(EDTA)，异硫氰酸苯基-EDTA(ITCBE)，二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，反式-环己基-二乙烯三胺五乙酸(CHXDTPA)和5-异硫氰酸苯基-1，10-菲罗啉-2，9-二羧酸(DCP)。

图1 重金属离子免疫分析常用双功能试剂(a-e)和新双功能试剂(f)的结构

Wylie[18]等人最初用谷胱甘肽络合汞离子，制备了汞离子的抗原，并制备出了抗汞离子的单克隆抗体，将金属离子的免疫分析方法应用到了实际中。随后，Blake等人采用了EDTA类双功能试剂制备了不同金属离子的抗原，如汞、镉、铅、铀和铬等[19-24]。这些研究成果，为重金属离子免疫分析方法的深入研究奠定了基础。

1.2 汞离子抗原制备方法的进一步研究

研究表明，上述方法在制备重金属离子的抗原时，金属离子被螯合剂包裹在里面，不能直接作为抗原决定簇的一部分刺激动物的免疫系统，所以得到的抗体绝大部分是针对金属-螯合剂的复合物整体的，而不能单独识别金属离子。这样得到的抗体必须是和螯合剂的亲和力很小，而对金属-螯合剂复合物有很强的亲和性和特异性。而且这种方法制备的抗体与其他金属离子的交叉反应较大，样品处理时要预先螯合，过程较为繁琐。如果选择一种新的双功能试剂，使其与重金属离子连接后，能够将金属离子暴露出来作为抗原决定簇免疫动物，得到针对单独的金属离子的抗体，这样在样品处理时不需要预先螯合，就能直接检测金属离子，使检测过程在很大程度上得到简化。

基于以上理论，我们以汞离子为研究对象[9]，选用带有羧基和巯基并含环状刚性结构的6-巯基烟酸(MNA)(图1f)为双功能试剂，羧基通过活化酯法与载体蛋白连接，巯基与汞连接。这样交联制得的免疫原，汞离子能够暴露出来作为抗原决定簇刺激动物免疫系统，从而得到针对单独汞离子的抗体。

2 汞离子抗体的制备及免疫分析方法的建立

在成功制备了合理修饰的免疫原后，取合适剂量免疫BALB/C小鼠，待检测小鼠血清的效价达到要求后，即可取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，通过细胞培养、间接竞争ELISA筛选，亚克隆等得到特异性的单克隆抗体。

我们运用自制的汞离子抗体，建立了测定汞离子的间接竞争ELISA法[9]。通过优化实验条件，在汞离子浓度范围为0.1～100 ng/mL的情况下，测定汞离子间接竞争ELISA法的IC50和LOD分别为1.12 ng/mL和0.08 ng/mL，表明方法具有很高的灵敏度，可以准确、快速、简单地检测环境以及食品中的汞离子。样品不需加入螯合剂就可直接测定，使检测过程更为简单。该方法为汞离子的检测提供了新的手段，同时，为重金属离子免疫分析方法的深入研究提供了一定的理论基础。

3 重金属离子免疫分析方法展望

传统的酶联免疫分析方法虽然方便、快速，但是灵敏度还不够高，目前重金属的免疫分析大部分集中于ELISA法，与其它分析方法结合较少，为了进一步提高方法的灵敏度及使检测更加方便，与其它分析方法联用检测重金属离子是未来发展的趋势。

3.1 基于表面增强拉曼光谱的重金属离子免疫分

析方法研究

表面增强拉曼光谱(SERS)用于标记免疫检测是标记免疫学与SERS相结合的一门新型的研究技术[25]。SERS应用于标记免疫分析，灵敏度非常高，甚至优于荧光[26]。常见的SERS标记免疫技术主要基于类似三明治结构的构建，即基底上的固相抗体与标记抗体通过与抗原结合形成“固相抗体-待测抗原-标记抗体”夹心复合物，通过对标记抗体中的拉曼活性分子SERS信号的识别进行免疫分析，这种模式主要用于大分子的检测。目前，Guichi Zhu等[27]将SERS应用到了盐酸克伦特罗的免疫分析方法中。由于小分子抗原只有单一的抗原决定簇，在进行免疫分析时，一般都采用竞争法，即包被抗原与待测物竞争与标记抗体反应，这既提高了方法的灵敏度，也将小分子免疫分析引入了一个新的研究领域。

用SERS检测重金属离子(铜离子)的方法袁亚仙等[28]已有报道，方法虽然应用了夹心法模式，但是并没有涉及到抗原抗体的反应，所以将重金属离子免疫分析方法与SERS结合是我们未来的研究方向之一。

3.2 胶体金免疫层析技术应用于重金属离子检测

方法的研究

胶体金免疫层析技术(CGICA)是将胶体金的标记技术与层析技术相结合建立起来的一种简单快速的方法。相较于其他免疫分析方法具有很多优点：方便快捷，检测所需时间短，只需要几分钟就可判定检测结果；不需要任何仪器和设备，肉眼即可观察；可以用于现场临时检测，方便携带；成本较低，操作简单；所需试剂较少，并且胶体金可以稳定保存，受外界影响较小[29-30]。

关于重金属的胶体金试剂条也已有报道，刘斌和向军俭[31-32]等制备了抗镉-EDTA的单克隆抗体，建立了胶体金免疫层析法快速测定镉离子，可以用来分析水样中的重金属镉的含量。Yong Tang[33]等制备了抗铅-DTPA的单克隆抗体，并研制出试剂条检测水样中的铅。我们拟将自制的汞离子单克隆抗体应用到胶体金试剂条的制备中，希望利用抗体可以直接检测单独的汞离子和样品不需要预先螯合的优点，建立检测汞离子的胶体金试剂条。这将为汞离子胶体金试剂条的市场化提供理论基础。

4 总结

重金属离子的免疫分析方法较传统检测方法而言，具有灵敏度高、特异性强、成本低廉等优点，但是它只是一种辅助方法，并不能代替传统的方法。重金属离子的免疫分析方法仍然有很多需要改进的地方，将免疫分析方法与其它高灵敏度、快速准确的方法结合是非常必要的。这对于环境、食品中重金属离子的检测有很大的意义。

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〔责任编辑 杨德兵〕

The Research of Mercury I ons I mmunoassay

WANG Yu-zhen，FENG Feng，QIN Jun，BAIYun-feng，WANG Hai-yan
(School of Chemistry and Chemical Engineering，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009)

Currently，h igh heavymetal pollution also causes a big threat to the public health.Due to its properties such as high sensitivity and specificity，rapid，simple of immunoassay，it has been widely used for the determination of heavymetals in food and environmental areas.This paper described the selection of bifunctional reagents in the preparation ofmercury ions antigen and the establishmentof immunoassaymethod.In addition，the trends of immunoassay combined with new analyticalmethodswere discussed.

mercury ions；immunoassay；monoclonal antibody；bifunctional reagent

X830.2

A

2013-04-10

国家自然科学基金资助项目［21175085］；山西省自然科学基金资助项目［2009011015－1］

王玉珍（1983－），女，山西朔州人，博士，讲师，研究方向：生物分析；*冯锋，男，博士，教授，通信作者。

1674－0874（2013）03－0040－03