高效液相色谱法测定酱油和食醋中4种对羟基苯甲酸酯

肖丽恒，吕任一，何学梅，谢启明

(1.楚雄州质量技术监督综合检测中心，云南 楚雄 675000;2.楚雄师范学院化学与生命科学系，云南 楚雄 675000)

对羟基苯甲酸酯类是一种广谱抑菌食品防腐剂，在食品生产、加工、储存等过程中广泛用于抑制微生物的繁殖，以防止食品腐败变质，延长食品保质期［1—2］。但过量使用，会严重危害人的身体健康。我国对对羟基苯甲酸酯类防腐剂的使用量和残留量上都有着十分严格的规定和要求，酱油、食醋中的最大使用量不超过0.25g/kg［3］。因此，为了确保人类身体健康和安全，建立快速、高效、高选择性和高灵敏度的测定食品中对羟基苯甲酸酯类防腐剂的方法具有重要意义。

当前，对羟基苯甲酸酯类防腐剂的测定方法主要有高效液相色谱法［4—9］、薄层色谱法［10—11］、毛细管电泳法［12］、气相色谱法［13—17］、高效液相色谱串联质谱检测法［18—19］等。其中，应用比较广泛的是高效液相色谱法和气相色谱法，而薄层色谱法和毛细管电泳法应用的相对较少，高效液相色谱串联质谱检测法检测投入较多，应用也不多。此外，对羟基苯甲酸酯类防腐剂有好多种，而且都在生活中广泛使用［16—17］，这就需要开发出能同时检测多种不同样品中多种添加剂的测定方法［12—15］。因此，本文拟建立一种能够快速、简单、高效和准确地同时测定酱油和食醋中4种对羟基苯甲酸酯的高效液相色谱法方法。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

高效液相色谱系统LC－20A(日本岛津公司)，配套二极管阵列检测器SPD－M20A及色谱管理软件LCsolution;输液泵LC－20AB;自动进样器SIL－20AC;色谱柱柱温箱CTO－20AC;去离子水纯化系统EasyDI8(美国Millipore公司);漩涡混合器QL－861;超声波清洗器AS20500AT;分析天平 (LA204、CPA225D);离心机 (凯达TG16G)。

乙腈为色谱纯，乙酸铵、乙酸锌、亚铁氰化钾、氢氧化钠等试剂均为分析纯。实验用水均为超纯水。

对羟基苯甲酸酯标准品 (美国Sigma公司):对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丙酯，纯度≥99%。

1.2 色谱条件

色谱柱:Diamonsil－C18，粒度5μm，4.6mm×250mm(ID×L);检测波长:254nm;流速:1.0mL/min;进样量:10μL;流动相A为乙腈，流动相B为乙酸铵缓冲液 (20mmol/L，并调节PH为4);柱温:40℃。梯度洗脱程序如下表1:

表1 梯度洗脱程序Table1 Gradient elution procedure

1.3 实验方法

1.3.1 标准贮备液和工作溶液的配制

分别准确称取25.0mg对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丙酯标准品于4个25 mL容量瓶中，先用少量乙腈溶解后，再用乙腈定容至刻度。配制成1.00 mg/mL的单标储备液，冷藏保存。

用移液管准确量取1mL各标准贮备液于10mL的容量瓶中，用乙腈定容到刻度，配制成100mg/L的中间液。

根据检测的实际要求，取中间液根据不同的浓度，用流动相稀释到相应浓度的混合标准工作溶液，浓度系列:0.0 mg/L、7.5 mg/L、12.5 mg/L、25.0 mg/L、37.5 mg/L、50.0mg/L。

1.3.2 样品准备和处理

摇匀并称取酱油或食醋样品5 g(精确至0.01 g)，置于50 mL比色管中，加入1mon/L的氢氧化钠溶液1 mL，加入适量的去离子水，漩涡混合1min，水浴超声波辅助提取10 min，取出，加入2mL乙酸锌和2mL亚铁氰化钾溶液混匀，调节pH至中性，用去离子水定容到50ml，慢速滤纸过滤，滤液经0.45 μm微孔滤膜过滤后作为试液供高效液相色谱仪测定。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的确定

酱油食醋营养成分十分丰富，含有大量的酱色、蛋白质及盐类。如果直接过0.45um的滤膜进行进样，会造成液相色谱柱的堵塞。因此，色谱分离前，须对样品进行净化处理，以除去多余的杂质，保护色谱柱，延长使用寿命。如用甲醇或者乙醇提取，样品中所含杂质较多，且甲醇有一定的毒性。而乙酸锌－亚铁氰化钾是蛋白质以及其它大分子极性物质的经典的沉淀试剂［9］，而且广泛运用于食品分析中，且使用方便。所以，本实验采用乙酸锌－亚铁氰化钾作沉淀剂，同时加1mL1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至中性，处理效果十分满意。

2.2 流动相的选择

为了选择合适的检测条件，分别对甲醇－水、甲醇－乙酸铵缓冲液、乙腈－水和乙腈－乙酸铵缓冲液四种流动相体系进行了试验。结果显示，使用乙腈－水流动相、甲醇－水流动相体系，在相同的试剂配比下，分析时间明显太长。而选择甲醇－乙酸铵缓冲液流动相体系，分析时间也较长。在同等条件下选择乙腈－乙酸铵缓冲液作为流动相，它能较好地分离四种对羟基苯甲酸酯类，而且能有效地缩短总分析时间。实验表明，当乙腈体积分数为30%时为初始的流动相最为适合，分离效果好，而且保留时间合适。

2.3 检测波长的选择

对羟基苯甲酸酯的吸收光谱波长分别为在226nm，248nm，257nm，255nm，256nm，253nm处表现高灵敏度［4—9］，但是，我们在进行检测时发现，在波长254nm灵敏度相对更好，因此选择254nm作为实验的最佳检测波长。

2.4 方法的评价

2.4.1 标准曲线的线性范围和最低检测限确定

对羟基苯甲酸酯类标准品混合溶液通过高效液相色谱采用1.2的检测条件进行检测分析，色谱图如图1所示。

图1 四种对羟基苯甲酸酯类标准品的高效液相色谱图Fig.1 Chromatograms of 4 p－hydroxybenzoates standards

实验结果表明，在乙腈－乙酸铵缓冲液为流动相条件下，各组分保留时间和分离效果都较好。用各组分的峰面积与质量浓度的相关关系进行线性回归分析，其中Y代表峰面积，X代表进样质量浓度，得出相应回归方程和相关系数。并且，对羟基苯甲酸酯在0.0～50.0 mg/L时，有着良好的线性关系。在此实验条件下，对羟基苯甲酸酯类以5倍基线噪声所对应的浓度作为方法的最低检测限。根据信噪比 (S/N=5)计算，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丙酯的检测限分别为0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.25 mg/kg、0.2 mg/kg。本方法的线性回归方程和检出限如表2所示。

表2 对羟基苯甲酸酯的线性回归方程和检出限Table 2 Linear regression equation and detection limits of p－hydroxybenzoates

2.4.2 准确度和精密度

选取酱油、食醋样品，分别按表3添加水平进行加标回收实验，同时做样品空白实验，空白结果如图3所示。

样品经过处理后，通过高效液相色谱仪进行测定。样品中对羟基苯甲酸酯类加标回收的HPLC检测，结果如图4所示。

图3 酱油样品色谱图Fig. 3 Chromatograms of a soy sauce

图4 酱油中添加4种对羟基苯甲酸酯色谱图Fig.4 Chromatograms of soy sauce added with 4 p－hydroxybenzoates standards

对样品在同一天内每一浓度进行平行测定6次，采用外标法对样品加标进行校正，取平均值计算回收率和精密度，结果见表3。实验表明，本方法加标回收率比较稳定 (86.3% ～101.6%)，不同样品在不同加标水平上的回收率比较稳定。不同浓度的对羟基苯甲酸酯在酱油、食醋样品中的相对标准偏差分别为0.9%～3.1%和0.7%～2.9%，结果见表4。精密度满足酱油和食醋中对羟基苯甲酸酯类含量的分析要求。

表3 酱油和食醋中对羟基苯甲酸酯的加标回收率和精密度结果 (n=6)Table 3 Recoveries and precisions of p－hydroxybenzoates in soy sauce and vinegar(n=6)

p－Hydroxybenzoates Added/(mg/kg)Average recovery/%soy sauce vinegar RSD/(%)soy sauce vinegar 593.3 92.3 3.1 2.3 IPP 10 94.5 97.7 1.8 1.215 99.1 99.5 1.9 1.6586.3 90.3 2.7 2.9 PP 10 97.6 101.6 1.7 2.415 99.5 99.3 0.9 1.1

3 结论

本文建立了高效液相色谱法测定酱油、食醋中四种对羟基苯甲酸酯类物质含量的方法。样品经过处理后，对羟基苯甲酸酯在0.0～50.0mg/L时，有着良好的线性关系，r=0.9999，四种对羟基苯甲酸酯的检出限可达到0.1～0.25mg/kg(S/N=3)。该方法效果稳定，操作简单，结果准确，为酱油、食醋中对羟基苯甲酸酯类物质的检测提供了一种新的快速、有效的检测方法。

［1］李永飞，沈良，齐艳，等.尼泊金复合酯在酱菜生产中的应用 ［J］.中国酿造，2004，（4）：19—20.

［2］牟冠文，李光浩.食品防腐剂的概况及其检测方法 ［J］.食品与发酵工业，2006，32（10）：103.

［3］GB 2760－2011，食品添加剂使用卫生标准 ［S］.

［4］查玉安，赵亚华.高效液相色谱法测定化妆品中7种防腐剂 ［J］.职业与健康，2002，18 （4）：34.

［5］靳克林.高效液相色谱法测定化妆品中防腐剂 ［J］.中国卫生检验杂志，2005，15（3）：317—318.

［6］聂西度，谢华林，彭书萍.高效液相色谱法测定化妆品中防腐剂的研究 ［J］.分析科学学报，2005，21 （2）：231—232.

［7］周建科，王立双，赵瑞峰.液相色谱法测定醋中对羟基苯甲酸酯类防腐剂 ［J］.中国调味品，2008，6 （6）：47—48.

［8］杨华梅.高效液相色谱法测定酱油中4种尼泊金酯含量 ［J］.中国酿造，2009，（10）：146—147.

［9］陈俊，周路明.亚铁氰化钾－乙酸锌在HPLC测定酱油中防腐剂的应用 ［J］.中国调味品，2007，（10）：72—73.

［10］王萍.薄层层析法测定化妆品中多种防腐剂 ［J］.环境与健康杂志，1997，14（4）：171.

［11］林秀蓉，古国隆，钟玉明.食品中对羟苯甲酸酯类防腐剂之简易快速气相层析定量分析 ［J］.台湾农业化学与食品科学，2000，38（1）：59—70.

［12］方明，李勇.饮料、酱菜中苯甲酸含量的高效毛细管电泳检测方法 ［J］.中国食品添加剂，2006，（2）：156—158.

［13］白艳玲，张彩虹，陈剑刚.化妆品8种防腐剂同时测定的气相色谱法 ［J］.环境与健康杂志，2004，21 （3）：170—171.

［14］刘刚，赵刚，王小芳.气相色谱法分析化妆品中防腐剂 ［J］.色谱，2002，20（3），274—276.

［15］鲍忠定.毛细管气相色谱内标法同时测定食品中8种防腐剂 ［J］.分析化学，2004，32 （2）：270—271.

［16］殷德荣.毛细管气相色谱法同时测定食品中多种防腐剂 ［J］.实用预防医学，2005，12 （1）：168.

［17］迪丽努尔·马力克，庞楠楠，刘虎威.快速气相色谱法测定食品中的六种常见防腐剂 ［J］.新疆师范大学学报 （自然科学版），2005，24（1）：51—53.

［18］吴刚，赵珊红，吴俭俭.凝胶渗透色谱净化—超高效液相色谱—串联质谱法测定皮革制品中7种尼泊金酯类防腐剂 ［J］.色谱，2011，29（6）：501.

［19］凌云，储晓刚，张峰.超高效液相色谱—串联质谱法同时测定调味料中的17种防腐剂和抗氧化剂 ［J］.色谱2011，29 （8）：723—730.