小剂量地塞米松对脓毒症大鼠金属基质蛋白酶9等炎症因子的影响

陈 昊 乔丽旻 周 超▲

1.上海市浦东新区周浦医院呼吸内科，上海 201318；2.联洋社区卫生服务中心内科，上海 200135

虽然目前对于皮质类固醇激素的临床使用尚有争议，2008拯救败血症患者运动（SSC）指南仍建议脓毒症休克持续低血压的情况下，若使用液体复苏以及升压药物无效时使用皮质类固醇激素[1]。地塞米松（Dexamethasone，DEX）作为临床上常用的皮质酮激素（glucocorticoid，GC），在临床上已进行广泛的应用。并有大量的文献表明小剂量的使用激素可以对脓毒症预后有一定改善[2-3]。本研究拟通过盲肠结扎穿刺（CLP）手术建立脓毒症大鼠模型后进行地塞米松干预，来研究、观察地塞米松对金属基质蛋白酶-9（MMP-9）和肿瘤环死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）的影响及对生存率的作用。

1 资料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠78只，体重235～260 g，SPF级大鼠，实验大鼠均购自第二军学动物实验中心。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及常规处理

78只SD大鼠完全随机分为CLP手术组、地塞米松治疗组（DEX），每组各 36只，组内分 12 h组（共 6只）、24 h组（共 10只）、48 h组（共 10只）、96 h组（共 10只）。各组分别在预定时间点处死存活的大鼠。DEX治疗组在手术完成后6 h皮下注射0.1 mg/mL的DEX。假手术组（sham）共6只，打开腹腔后仅翻动肠道即关腹，不予手术处理。

1.2.2 建立重症脓毒症动物模型

1.2.2.1 购入动物后进行适应饲养1周，开始实验前禁食12 h。按照40 mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥。注射麻醉后，将动物置于仰卧位固定于操作板上，腹部手术区去毛后消毒后腹壁作长2 cm切口，切口进腹在分离回盲瓣末端并结扎盲肠，以针头在结扎端处穿刺3次后挤出粪便，最后间断缝合关腹，并在皮下注射生理盐水100 mL/kg抗休克。实验各分组在预定12、24、48 h时间点处死大鼠，处死后实验对象并取标本。假手术组仅开腹翻动肠道后缝合，不予手术处理。术后不予生理盐水补液。假手术组建立10 min后立即予处死。

1.2.2.2 DEX治疗组在手术完成后6 h皮下注射0.1 mg/mL的DEX。CLP组不进行任何干预治疗。

1.3 评价指标测定

1.3.1 生存率

记录各实验时间点大鼠的生存数目。

1.3.2 采集标本

1.3.2.1 采集血清标本：处死大鼠并取血置于离心管中，使用低温离心机离心 30 min（2000 r／min），离心半径 13.5 cm，取血清后立即冻存于-80℃冰箱中，待测定。

1.3.2.2 肺组织取材：处死实验动物后开胸取肺，吸水纸吸取左肺表面液体，电子天平称重后立即置于恒定90℃烤箱中烘干72 h后称取干重，计算肺组织干/湿重比（W/D）。

1.3.3 血清炎症因子的测定

采取双抗体夹心ELISA法检测血清炎症因子MMP-9及 TNF-α、IL-6、白介素-8（IL-8）测定，试剂盒均购自上海西塘公司。严格按照试剂盒说明操作。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物生存率记录结果

地塞米松干预96 h后大鼠生存率有所改善，各组生存率见表1。经χ2检验24、48 h组生存率差异均无统计学意义（P ＞ 0.05）。

表1 实验大鼠生存率情况

2.2 实验动物W/D结果

CLP组的W/D水平在12 h出现下降，24 h组W/D水平仍进一步下降。48 h W/D水平开始上升。而在DEX组W/D水平同CLP变化类似，12 h组DEX干预后W/D低于CLP组（P＜0.05）。DEX干预组24 h组和48 h均高于CLP组。见表2。

2.3 实验动物 TNF-α、IL-8、IL-6、MMP-9 血清水平表达结果

2.3.1 TNF-α

CLP术后TNF-α水平出现明显上升，DEX组除12 h组外与同时间点CLP组比较均出现下降，但差异无统计学差异（P ＞ 0.05）。 见表2。

2.3.2 IL-8

DEX组比CLP组同时间点有下降趋势，DEX干预后除12 h外各时间点与对照组比较均出现下降。48 h与对照组比较显著下降，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 TNF-α、MMP-9、IL-6、IL-8、W/D 结果比较（±s）

表2 TNF-α、MMP-9、IL-6、IL-8、W/D 结果比较（±s）

注：与 CLP组同时间段比较，*P＜0.05；与 sham 组同时间段比较，#P＜0.05，##P＜0.01；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；MMP-9：金属基质蛋白酶 9；IL-6：白介素-6；IL-8：白介素-8；W/D：肺组织干/湿重比；Sham：假手术组；DEX：地塞米松；CLP：盲肠结扎穿刺；“-”代表无数据

8.59±7.21 71.65±37.79 89.06±33.85 109.93±10.99-79.18±15.44 74.62±18.55 102.62±22.71 107.94±61.11 21.00±5.11 59.35±19.43 85.28±4.87 117.79±44.16-62.63±37.70 42.04±15.21#33.08±15.72##42.22±11.05 TNF-α（ng/L） IL-6（ng/L）150.15±43.99 1665.12±256.45 2201.55±147.39 3582.41±2304.93-2108.11±745.38 2033.23±220.48 1576.75±534.40##2115.82±604.54 IL-8（ng/L）12.15±5.66 12.47±2.50 23.47±11.62 45.27±21.38-12.39±11.71 15.67±1.20 16.57±5.56##20.99±2.51 4.87±0.13 4.63±0.11 4.40±0.14 4.49±0.10-4.41±0.02*4.48±0.07 4.53±0.19 4.58±0.04 MMP9（ng/L） W/D sham组CLP组12 h组24 h组48 h组96 h组DEX组12 h组24 h组48 h组96 h组6 6630 6973组别 只数

2.3.3 IL-6

DEX组比CLP同时间点比较有下降趋势，DEX干预后除12 h外各时间点与对照组比较均出现下降。24 h与对照组比较显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），48 h与对照组比较显著下降，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表2。

2.3.4 MMP-9

DEX组比CLP组同时间点有下降趋势，DEX干预后除12 h外各时间点与对照组比较均出现下降。48 h与对照组比较显著下降，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表2。

3 讨论

脓毒症目前已成为住院患者最主要的死亡原因之一[4]。地塞米松对炎症及免疫反应有强大的抑制效应，正确使用可以有效地改善脓毒症的预后。不同的用药剂量以及时间对于激素使用的疗效均有明显的影响[5-6]。综合既往的文献报道，本实验选择在CLP手术后6 h皮下使用小剂量的地塞米松。败血症早期应用糖皮质激素，可以激活免疫细胞，防止中性粒细胞活化及内皮细胞损害，减少花生四烯酸的释放，抑制炎症因子抗休克。减少前列腺素、氧自由基等炎症介质的释放，在脓毒症时起到保护脏器功能的作用。本实验结果，脓毒症大鼠的生存率出现了明显改善，仅有DEX组96 h仍有生存。而在24 h及48 h虽未有统计学差异，可能是仅是样本量较少的原因。使用地塞米松后大鼠一般情况也有明显改善，大鼠的进食量以及现活动较多，发热，寒战，竖毛情况均有改善。本实验证实了在脓毒症发生早期使用小剂量的地塞米松可以有效的改善脓毒症的预后。

肺损伤过度的内源性炎症介质的释放是脓毒症发生的最重要的原因[7-8]。大量炎症因子参与了脓毒症的过程[9-11]，炎症因子参与了逐次炎性级链反应，最终加速了脓毒症的进程。本次实验中发现使用地塞米松干预后，所检测的炎症因子表达水平最终均出现下降。但同时发现地塞米松干预后早期炎症因子水平下降尚不明显，24 h组出现了明显的下降。根据本实验中地塞米松对于炎症因子水平表现出广泛的抑制作用，以及使用地塞米松后大鼠生存率和一般情况的改善，笔者考虑地塞米松可能通过下调炎症介质水平水平对减轻脓毒症的损伤。

TNF-α，被认为是脓毒症病理过程中最重要的炎症因子，是炎症刺激下早期的始动炎症因子。IL6在TNF之后升高，IL-6水平可以作为疾病严重程度及死亡率的预测[12]。在本实验中地塞米松明显下调TNF-α及IL-6，对于IL-6水平调控较为明显。

MMP-9是金属蛋白酶家族中分子质量最大的酶，又称明胶酶B。MMP-9参与细胞外基质的破坏和改建。对于胶原和明胶以及纤维连接蛋白，层黏连蛋白等的降解均起到重要作用。当炎症细胞被激活，炎症因子大量释放，从而最后促进MMP-9的高水平表达。MMP-9在组织重塑、伤口愈合、炎症免疫等病理生理过程中均有重要作用[13]。目前有文献表明MMP-9可能能作为炎症的早期检测指标[14]，并能作为一个预示炎症的发生的标志物[15]。

脓毒症发生后炎症因子的释放可以被初步分为两阶段：脓毒症发生后炎症因子被激活释放，炎症因子在促进全身炎症的同时，也活化了中性白细胞弹性蛋白酶（NE）和金属基质蛋白酶（MMPs）[16]。在试验中笔者观察到地塞米松干预后12 h炎症介质水平尚无明显变化，24 h和48 h出现明显下降，故考虑地塞米松在重度脓毒症发生后可能对晚期炎症介质的效果更为明显。

MMP-9及IL-8均为脓毒症晚期炎症因子。已有报道表明MMP-9在脓毒症开始后裂解活化IL-8[17]。同时IL-8作为一个中性粒细胞趋化因子，而中性粒细胞在活化后又能释放MMP-9。IL-8同MMP-9可能在脓毒症过程中已形成正反馈。MMP-9对于IL-8有很强的趋化作用[18]。本实验中在地塞米松的干预下MMP-9及IL-8水平均出现了明显下降，地塞米松调控晚期炎症因子的作用可能能有效改善脓毒症的预后。

MMP-9对于细胞外基质及基底膜亲和力高，大量释放时破坏上皮的完整性破坏，可使蛋白质以及体液漏出。引起肺水增多，提高肺干湿重比。但在本实验中未出现MMP-9同W/D的同步变化。笔者考虑在重度CLP手术后，严重脓毒症下血管内皮细胞完整性遭破坏引起血浆外渗，但实验中大鼠停止进食饮水导致大鼠处于严重的休克状态，对照DEX干预组大鼠一般状态较好饮水较多休克状态得到一定程度改善。MMP-9破坏基底膜后由于体液量不足，故未出现明显的肺水肿。

综上所述，脓毒症早期小剂量使用地塞米松可以有效的改善脓毒症的预后。地塞米松通过抑制炎症因子改善脓毒症预后，地塞米松对于脓毒症晚期炎症因子水平MMP-9及IL-8的调控较TNF-α等早期炎症因子可能更为重要。这可能对于激素干预治疗提供新的研究方向。但尚需进行进一步的实验增加样本数来证实地塞米松对于生存率的改善。

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