去氢表雄酮的生物转化、衍生物合成及细胞毒活性研究

单丽红，乔 星，李 央，张璐珈，焦 凯，刘宏民

(1.郑州大学药学院，河南郑州450001;2.郑州大学新药研发中心，河南郑州450001)

0 引言

甾体化合物广泛分布于自然界及生物体内，是一类重要的生物活性分子，被誉为药学领域的“Golden Egg”［1］.近年来，去氢表雄酮(Dihydroepiandrostrone，DHEA)及其在肝脏中的主要代谢产物7-羟基DHEA表现出非常好的生物活性，如提高试验动物的免疫能力［2-3］，阻止体外神经元缺氧细胞死亡［4］，并且对治疗阿尔茨海默病和降低体重也有一定作用［5］.这些重要的研究成果引起了众多学者对甾体7-羟基衍生物的研究兴趣.

虽然甾体7位的羟基化用化学方法相对其它位置比较容易进行，但是这些方法路线长，所用试剂昂贵或有毒，不利于进行大规模生产.利用微生物转化法可以很好的克服化学合成法的不足，还具有高效、低耗、污染少等明显优势，符合现代“绿色化学”的要求.

据文献报道在甾环16位引入芳亚甲基结构，可使其产生细胞毒作用［6-7］.因此本课题组利用 Claison-Schimidt缩 合 反 应 在 7α-羟 基DHEA的16位引入系列取代苯亚甲基基团，合成得到8个未见文献报道的新化合物，并测试了这些化合物对人食管癌EC109细胞株的细胞毒作用.

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

试剂:去氢表雄酮(99%，汉江振华生物科技有限公司);葡萄糖(分析纯，汕头市西陇化工厂)，蛋白胨和酵母膏(生化试剂，北京奥博星生物技术责任有限公司);磷酸二氢钾(分析纯，汕头金沙化工厂);琼脂(Slandand International Inc);薄层层析和柱层析硅胶(化学纯，青岛海浪硅胶干燥剂厂)，所用工业溶剂均经重蒸.仪器:WC-1型显微熔点仪;BIO-RAD公司FTS-40型红外分光光度计(KBr压片);瑞士Bruker DPX-400型超导核磁共振仪;HZQ-Q全温振荡器;HVE-50高压蒸汽灭菌锅.菌种:卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus，自筛)，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC2256.斜面培养基:PDA培养基;发酵培养基:葡萄糖30 g，蛋白胨12 g，酵母膏1.0 g，磷酸二氢钾 0.9 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 4.5.

1.2 制备和表征

1.2.1 生物转化

按照1.1节中发酵培养基的组成配置1 000 mL发酵培养基，分装至10个厄伦美厄烧瓶，高压灭菌锅121℃灭菌20 min，待培养基冷却后在安全柜中接种，接种后的培养基放置恒温振荡器中，培养48 h(28℃，220 r/min)后，将1.0 g DHEA 溶解于10 mL丙酮后加入上述培养基，继续培养转化4 d.转化结束后，过滤除去菌丝体，发酵液用乙酸乙酯萃取3次，萃取液浓缩后用饱和NaHCO3、饱和食盐水及水各洗3次，无水硫酸钠干燥后减压蒸干溶剂，得到白色固体，柱层析(V乙酸乙酯:V石油醚=1∶3)分离得到化合物1和2，结构如图1所示.

图1 卷枝毛霉转化DHEAFig.1 Biotransformation of DHEA by Mucor circinelloides

化合物1:白色固体粉末，收率为31.56%;mp 179.3～181.2℃ (literature 181.5～183.5℃［8］); ［α］20D-71°(c.0.21，MeOH);IR(KBr)ν:3 431，2 933，1 730，1 657，1 621，1 375，1 057 cm-1;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ0.89(3H，s，H-18)，1.02(3H，s，H-19)，3.46(1H，m，H-3)，3.89(1H，t，H-7，2J=7.6 Hz)，5.57(1H，d，H-6，2J=5.2 Hz);13C NMR(100 MHz，CDCl3): δ:223.9，146.8，124.6，71.9，64.9，49.6，46.4，43.8，42.9，38.6，38.6，38.0，36.6，32.4，32.1，22.7，21.2，18.6，13.7;HR-MS m/z%:［M+H］+305.211 2(calcd.305.2117).

化合物2:白色固体粉末，收率为12.59%;mp 208.6～209.8℃ (literature 215～216℃［8］);［α］D20-93°(c.0.29，MeOH);IR(KBr)ν:3 364，2 930，1 730，1 660，1 629，1 380，1 056 cm-1;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ0.78(3H，s，H-18)，0.98(3H，s，H-19)，3.26(1H，m，H-3)，3.70(1H，d，H-7，2J=8.0 Hz)，5.18(1H，s，H-6);13C NMR(100 MHz，CDCl3): δ220.5，141.6，127.1，71.3，70.0，50.9，48.2，47.3，41.9，39.3，36.8，36.3，35.7，31.7，31.3，24.2，20.2，19.0，13.4;HR-MS m/z%:［M+H］+305.211 5(calcd.305.211 7).

1.2.2 3β，7α-二羟基-16-苯亚甲基雄甾-5-烯-17-酮衍生物1a-h的合成

图2 化合物1a～h的合成Fig.2 Synthesis of compound 1a～h

化合物1 100 mg(0.33 mmol)溶于10～20 ml 95%乙醇，加入固体氢氧化钠0.2～0.3 g，室温搅拌10 min，加入苯甲醛(0.05 ml)或各种取代苯甲醛(0.4 mmol)，继续室温搅拌，TLC检测反应完全后，减压蒸干乙醇，加入20～30 mL乙酸乙酯使瓶内固体溶解，继而用饱和食盐水15 mL分三次洗涤，至有机相呈中性，再将有机相用水洗1-2次，无水硫酸钠干燥，减压蒸干乙酸乙酯，所得固体混合物可用柱层析(V乙酸乙酯:V氯仿=2:1)的方法分离纯化.

化合物1a:白色固体粉末，收率见表1，mp:187.3～188.2℃;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ 7.55(2H，d，J=7.18 Hz)，7.37(2H，d，J=7.39 Hz)，7.35(1H，d，J=5.9 Hz)，7.26(1H，s)，5.65(1H，d，J=5.5 Hz)，4.06(1H，s)，3.57(1H，m)，1.05(3H，s)，0.98(3H，s);13C NMR(100M Hz，CDCl3): δ 210.4，147.4，136.6，136.6，134.0，131.2，131.2，130.0，129.3，129.4，124.4，71.9，65.2，47.6，43.9，43.5，42.7，38.3，37.5，37.6，32.0，31.9，30.1，20.9，19.0，14.8;HR-MS m/z%:［M+H］+393.241 6(calcd.393.242 9).

表1 化合物1a～h的结构和收率Tab.1 Structure and yield of comp.1a～h

化合物1b:白色固体粉末，收率见表1，mp:161.7～163.4℃;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ 8.26(2H，d，J=8.36 Hz)，7.68(2H，d，J=8.36 Hz)，7.45(1H，s)，5.67(1H，d，J=4.56 Hz)，4.06(1H，s)，3.59(1H，m)，1.00(3H，s)，0.87(3H，s);13C NMR(100M Hz，CDCl3):δ 208.8，147.4，146.8，142.0，139.9，130.7，130.7，130.3，123.8，123.9，123.4，71.1，64.4，47.0，43.1，42.8，41.9，37.6，36.8，36.8，31.3，31.1，29.4，20.1，18.3，13.9;HR-MS m/z%:［M+H］+437.219 8(calcd.437.220 2).

化合物1c:白色固体粉末，收率见表1，mp:172.5～173.6℃;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ 8.39(1H，s)，8.21(1H，d，J=8.93 Hz)，7.83(1H，d，J=7.76 Hz)，7.59(1H，t，J=15.94 Hz)，7.46(1H，s)，5.67(1H，d，J=5.14 Hz)，4.08(1H，s)，3.59(1H，m)，1.07(3H，s)，1.01(3H，s);13C NMR(100 MHz，CDCl3):δ 209.3，146.7，136.3，135.1，134.1，131.8，131.5，131.5，128.9，128.9，123.5，71.2，64.4，46.9，43.2，42.8，41.9，37.6，36.8，36.9，31.3，31.2，29.3，20.1，18.3，14.0;HR-MS m/z%:［M+H］+427.203 5(calcd.427.204 0).

化合物1d:淡黄色固体粉末，收率见表1，mp:168.2 ～ 169.8℃;1H NMR(400 MHz，CDCl3): δ 7.53(2H，d，J=8.50 Hz)，7.38(1H，s)，7.08(2H，t，J=17.2 Hz)，5.63(1H，d，J=5.03 Hz)，4.04(1H，s)，3.54(1H，m)，1.04(3H，s)，0.96(3H，s);13C NMR(100M Hz，CDCl3): δ 209.6，164.3，161.8，146.6，135.4，132.3，132.2，132.0，123.5，115.9，115.7，71.1，64.4，46.9，43.2，42.8，41.9，37.6，36.9，36.9，31.2，31.2，29.2，20.1，18.3，14.0;HR-MS m/z%:［M+H］+411.233 6(calcd.411.233 5).

化合物1e:白色固体粉末，收率见表1，mp:179.3 ～180.8℃;1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)):δ 7.61(1H，s)，7.57(1H，d，J=7.72 Hz)，7.40(1H，m)，7.08(1H，d，J=8.2 Hz)，7.04(1H，t，J=14.96 Hz)，5.45(1H，d，J=5 Hz)，3.84(3H，s)，3.30(1H，m)，0.96(3H，s)，0.88(3H，s);13C NMR(100 MHz，DMSO-d6): δ 208.8，158.4，144.0，136.5，131.2，129.6，126.1，124.4，123.8，120.6，111.5，69.9，62.7，55.8，46.6，43.3，42.3，42.1，37.1，36.7，31.5，31.4，28.9，19.9，18.1，13.9;HR-MS m/z%:［M+H］+422.2451(calcd.422.2457).

化合物1f:白色固体粉末，收率见表1，mp:185.1～186.3℃;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ 7.36(1H，s)，6.77(2H，s)，5.65(1H，d，J=4.84 Hz)，4.03(1H，s)，3.88(9H，s)，3.58(1H，s)，1.05(3H，s)，0.98(3H，s);13C NMR(100 MHz，CDCl3): δ 209.5，153.1，146.7，139.3，135.0，133.4，131.1，123.4，107.7，107.7，71.2，64.4，61.0，56.1，56.2，46.9，43.2，42.7，41.9，37.6，36.9，31.3，31.2，29.1，20.1，18.3，14.0;HR-MS m/z%:［M+H］+483.2740(calcd.483.2746).

化合物1g:白色固体粉末，收率见表1，mp:174.2～176.1℃;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ 7.668(1H，d，J=7.61 Hz)，7.51(1H，s)，7.43(1H，t，J=7.90 Hz)，7.108(1H，d，J=8.41 Hz)，7.01(1H，d，J=7.48 Hz)，5.45(1H，d，J=5.40)，3.60(1H，d，H-7，J=2.58 Hz)，3.33(1H，m，H-3)，2.86(1H，t，H-17，J=8.7 Hz)，1.05(1H，s，H-19)，0.97(1H，s，H-18);13C NMR(100M Hz，CDCl3): δ 208.4，157.7，145.1，135.5，131.2，128.9，126.0，124.7，122.3，120.2，111.7，69.0，62.5，56.8，46.2，43.0，42.5，42.1，37.3，36.5，36.0，33.5，31.4，28.6，19.7，18.3，13.5;HR-MS m/z%:［M+H］+422.245 5(calcd.422.2457).

化合物1h:白色固体粉末，收率见表1，mp:180.1 ～182.4℃;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ7.67(1H，s)，7.53(1H，d，J=7.72 Hz)，7.38(1H，m)，7.02(1H，d，J=8.1 Hz)，7.04(1H，t，J=14.90 Hz)，5.45(1H，d，J=5.2 Hz)，3.78(3H，s)，3.35(1H，m)，1.04(3H，s)，0.86(3H，s);13C NMR(100 MHz，CDCl3):δ 208.8，159.2，143.7，144.0，135.6，128.9，127.8，125.1，120.8，114.7，71.6，65.3，53.1，56.2，51.0，42，3，41.7，39.8，38.0，37.2，34.1，31.3，25.9，20.6，19.3，19.0;HR-MS m/z%:［M+H］+408.229 7(calcd.408.230 1).

1.2.3 3β，7α-二羟基-16-苯亚甲基雄甾-5-烯-17-酮衍生物1a～h的细胞毒活性研究

采用MTT法，考察了化合物1a～h对人食管癌上皮细胞株EC109的抑制活性.结果如表2所示.考虑到化合物1a～h的结构中均形成了α，β不饱和酮的结构，根据文献报道，从中药冬凌草中提取的冬凌草甲素(Oridonin，图3)普遍用于治疗消化道肿瘤，其抗肿瘤活性中心就是结构中的α-环外亚甲基环戊酮单元［9］，因此我们选择冬凌草甲素作为阳性对照品.

图3 Oridonin的结构Fig.3 Structure of Oridonin

表2 化合物1a～h对 EC109细胞株的抑制率(50 μg/mL)Tab.2 Inhibition rate of EC109 cells by comp.1a～h

2 结果与讨论

2.1 生物转化

从卷枝毛霉转化DHEA的发酵液中经柱层析分离得到两个纯的化合物1、2，经IR、NMR及HRMS等多种方法确证，并与文献［8］对照，分别确定为DHEA 的7α-和7β-羟基衍生物.其中7α-羟基DHEA的收率(31.56%)较7β-羟基 DHEA(12.59%)为高，是主要转化产物.

2.2 3β，7α-二羟基-16-苯亚甲基雄甾-5-烯-17-酮衍生物1a～h的合成

以7α-羟基 DHEA(1)为原料，利用 Claison-Schimidt缩合反应，使其分别与苯甲醛及多种取代苯甲醛进行反应，在其16位引入系列取代苯亚甲基基团，共得到8种衍生物1a～h，均为未见文献报道的新化合物.以化合物1a为例，在1H NMR谱中，7.26处出现一个单峰，判断为苄位氢的信号，同时在δ 7.55-7.35处也出现了单取代苯的质子信号.13C NMR谱中苯环碳的信号则为147.4(C-1’)，126.6(C-2’，6’)，131.2(C-3’，5’)，134.0(C-4’).由以上分析可以判断1a的结构为3β，7α-二羟基-16-苯亚甲基雄甾-5-烯-17-酮.

2.3 3β，7α-二羟基-16-苯亚甲基雄甾-5-烯-17-酮衍生物1a～h的细胞毒活性研究

甾体化合物在抗肿瘤领域的应用已得到广泛证实［10］，因此，笔者对所合成的甾体化合物进行了体外细胞毒活性筛选.表2列出了化合物1a-h对人食管癌上皮细胞株EC109的抑制活性.从表中所显示的结果可以看出经过转化后得到的羟基化衍生物1、2的抑制活性相应比其原料DHEA有所提高，说明引入羟基可增强其抗肿瘤作用.而以1为母体进行改造的苯亚甲基衍生物1a～h均比其母体化合物1的活性有明显提高.这说明在甾体结构中引入苯亚甲基结构可显著增强其细胞毒活性，而且这种体外抑制活性和苯环上的取代基也有一定关系，吸电子基团比斥电子基团的活性好，但与取代基的位置关系不大.

3 结论

笔者利用卷枝毛霉对去氢表雄酮进行了生物转化研究，从发酵液中分离得到其7α-和7β-羟基化产物，并利用Claison-Schimidt缩合反应在7α-羟基去氢表雄酮的16位引入带有不同取代基的苯亚甲基结构，得到8个新化合物，细胞毒实验表明引入苯亚甲基结构的衍生物对人食管癌上皮细胞株EC109有较强的抑制活性.

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