玉米芯抗肿瘤活性研究

武海丽，单树花，袁琳洁，刘庆午，赵文彬，李卓玉*

1山西大学生物技术研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室;2山西大学生命科学学院，太原 030006

结肠癌是世界第三大常见的消化道恶性肿瘤，近年来发病率呈逐年上升趋势，其死亡率仅次于肺癌和肝癌［1，2］。由于肿瘤的化疗方法产生明显的毒副作用，因此，寻找天然抗肿瘤药物成为人类向重大疾病作斗争的重要手段。目前，国内外学者已经从天然产物中分离出多种抗肿瘤活性物质，如黄酮、生物碱等［3］，但关于农产品废弃物抗肿瘤活性物质的研究报道较少。

玉米芯是玉米果穗脱去籽粒的穗轴，占玉米棒重量的20% ～30%。我国年产玉米约15亿吨，相应玉米芯的产量估计在4000万吨左右，除了少量用作糠醛、木糖醇等产品的原料外，很大一部分被作为农业废弃物直接焚烧处理，这不仅造成资源的极大浪费，同时也造成了环境污染［4］。资料显示，玉米芯纤维成分具有调整肠胃，通秘防癌，降低胆固醇，控制肥胖，消除外源有害物质汞、砷、镉等功能，因此，玉米芯作为一种来源丰富、易于收集、价格低廉的农业废弃物，具有广阔的研究与开发前景［4］。

本实验主要以玉米芯作为研究对象，采用生物学化学方法获得玉米芯水提物;用细胞生物学方法检测玉米芯水提物对肿瘤细胞增殖的影响;采用DAPI染色法探讨玉米芯水提物对细胞凋亡的影响;研究玉米芯水提物的抗癌活性及其机制，为玉米农副产品抗肿瘤活性物质的深度开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米芯(Zea mays)，购自山西省太原市天下谷有限公司;结肠癌细胞株:DLD1、SW480、SW620，正常细胞株:HL-7702，由本实验室保存;改良型RPMI-1640培养基、无支原体胎牛血清、胰蛋白酶(Thermo Scientific Hyclone);MTT(北京索莱宝科技有限公司);二甲基亚砜(DMSO);DAPI;青链霉素(100X);NaCL、KCL、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、Trition X-100、盐酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

D-37520 型离心机(Biofuge stratos，Germany);FV10000荧光显微镜(Olympus，Japan);CL410型-80℃冰箱(Hetofrig);153型CO2细胞培养箱(Heto-HoltenA/S，Denmark);SPT 倒置显微镜(Olympus，Japan);恒温水浴锅(Ploystat CCI，Germany);超净工作台(SW-CJ，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司);YDS-120-216型液氮储存罐;酶标仪(Biorad Model 550);MP511型精密PH仪;570 nm滤光片;细胞培养96孔板，细胞培养六孔板，封口膜，血细胞计数器，磁力搅拌器，无菌过滤器，冷凝管。

1.3 实验方法

1.3.1 提取物的制备［5］

将15 g材料分别经10倍量蒸馏水加热回流提取3次，合并3次滤液;用高速冷冻离心机在4℃下，5000 rpm离心10 min，取上清用布什漏斗过滤，将所得滤液水浴蒸干，浓缩成浸膏状;用分析天平称量，计算得率，再将浸膏制成100 mg/mL备用。采用75%乙醇提取，即得各材料的醇提物，计算醇溶浸膏得率，并制成100 mg/mL备用。得率(%)=提取物重量(g)/原材料重量(g)×100%

1.3.2 玉米芯水提液的组分分析

参考Bradford的方法［6］，用蛋白质标准品配制不同浓度的系列，考马斯亮蓝G250显色，5～15 min内在分光光度计测定595 nm处的吸光值，取3次重复平均值，绘制标准曲线。再用相同方法处理测定样品的吸光值，根据标准曲线计算蛋白质浓度。参照李玲等人方法［7］，采用3，5-二硝基水杨酸法测定多糖含量，。

1.3.3 细胞培养

人结肠癌细胞系 DLD1、SW480、SW620、人肝细胞HL-7702培养于含10%胎牛血清、100U/mL青链霉素的RPMI-1640培养基中，置于5%CO2、37℃的培养箱中。

1.3.4 MTT 法检测细胞活性

选取对数生长期的 DLD1、SW480、SW620、HL-7702细胞，按常规细胞传代的方法将细胞制成悬浮液，取100 μL滴于细胞计数板上，于倒置显微镜上进行细胞计数，调整细胞浓度为8×104/mL，接种到96孔培养板中，每孔100 μL，于37℃培养箱孵育24 h 后，加入不同浓度(1、2、4、6 mg/mL)的提取物20 μL，每样设五个复孔，并用不加药的培养基作为对照。待药物作用24 h后吸弃孔内液体，用PBS洗两次加入新鲜培养基，防止药物颜色干扰结果，每孔加5 mg/mL MTT溶液20 μL，继续孵育4 h后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，使紫色结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上于570 nm波长，测定各孔光吸收值(A值)，并计算细胞生长抑制率，计算公式如下:

1.3.5 DAPI染色检测细胞凋亡

常规方法培养细胞，调整细胞浓度为8×104/mL，接种到6孔板(内放置盖玻片)中，每孔1 mL，待细胞贴壁后，加入2 mg/mL的玉米芯水提物200 μL，并用不加药的培养基作为对照，处理24 h后，弃掉旧培养液，用-20℃预冷的4%的多聚甲醛固定30 min，加100 μL 0.3%Triton-X-100 清洗液室温通透细胞10 min，最后加DAPI染色液100 μL，室温避光染色15 min，甘油封片，在荧光显微镜下观察。

1.3.6 统计学处理

结果中的数据表达为均值±标准差(Mean±SD)，数据图中用误差棒(Error Bar)表示标准差，单因素分析采用Student’s t检验，数据经SPSS16.0统计分析，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 玉米芯水提取、醇提取液得率

称取玉米芯原材料15 g进行水提和醇提，将提取液浓缩蒸干称干重，计算得率。结果表明，玉米芯采用不同溶剂提取所得的提取液得率差别较大，水提物得率约为6%，而醇提物得率约为2%左右，说明玉米芯的水溶成分多于醇溶成分。

2.2 玉米芯水提液的组分分析

资料显示，玉米芯主要是由半纤维素、纤维素组成。由此推测玉米芯水提取物的有效成分为多糖。因此，分别采用Bradford法和3，5-二硝基水杨酸法测定了玉米芯水提液中蛋白及多糖的含量。结果表明，玉米芯水提液中蛋白浓度为0.145 mg/mL，糖含量为23.2 mg/mL。结果表明，玉米芯水提液的主要成分为多糖，该多糖类物质对结肠癌细胞有特异杀伤作用，而对正常细胞作用不明显。

2.3 玉米芯提取物对DLD1细胞增殖活力的影响

采用MTT法比较玉米芯水提取物和醇提取物对DLD1细胞增殖的影响。结果表明，玉米芯水提物对肠癌细胞DLD1生长有明显抑制作用，而其醇提物对DLD1细胞生长无明显抑制(如图2)。

图1 玉米芯提取物对DLD1细胞增殖活力的影响Fig.1 The influence of corncob extraction on DLD1 proliferation

2.4 不同浓度的玉米芯水提物对结肠癌细胞株DLD1、SW480、SW620 增殖活力的抑制

为了比较玉米芯水提物对肠癌细胞株DLD1、SW480、SW620和正常细胞HL-7702细胞增殖活力的影响，采用MTT法测定不同浓度玉米芯水提物对各细胞增殖能力的影响。数据显示，各浓度的玉米芯提取物对这几种肠癌细胞的增殖均有抑制作用。其中，低剂量组(1 mg/mL)对细胞的增殖抑制率较低，随着药物浓度的增加，增殖抑制率也增加，且呈明显的量效依赖关系(如图3A)。玉米芯水提物对不同的结肠癌细胞株抑制能力不同，其中对SW480细胞抑制能力最强，SW620细胞次之，对DLD1细胞抑制能力最弱，在作用24 h后，半数抑制浓度(IC50)分别为2、3、4 mg/mL。玉米芯水提物在低浓度时对正常细胞HL-7702没有抑制作用，高浓度时略有抑制作用，其半数抑制浓度为6 mg/mL(如图3B)。

2.5 玉米芯水提物对细胞凋亡的影响

图2 玉米芯水提物对不同细胞增殖抑制能力的比较Fig.2 Comparison of cell proliferation inhibition effect of corncob on different cells

为观察玉米芯水提物对细胞凋亡的影响，在倒置显微镜下观察了经过该水提物处理后的细胞形态，用DAPI进行细胞核染色，置于荧光显微镜下观察细胞核的变化(用359 nm激发光)，结果如图4-A，B所示;观察多个视野，统计各细胞系的凋亡率(如图4-C)。

图3 玉米芯水提物对细胞凋亡的影响Fig.3 The effects of aqueous extract of corncob on apoptosis

体外培养的结肠癌细胞经一定浓度的玉米芯水提物作用24 h后，在倒置显微镜下观察(如图4A)，发现细胞形态发生了明显的改变，细胞变圆，细胞体积也有所变小，贴壁细胞明显减少，由贴壁而脱落悬浮于培养液中;而对照组细胞胞质均匀，伸展性好，生长良好。正常细胞HL-7702在药物处理前后细胞核形态变化不是很明显。

玉米芯水提物处理24 h后的各肠癌细胞株经DAPI染色后，置于荧光显微镜下用359 nm激发光观察细胞核的变化，结果见图4B。由图可知，各细胞株的对照组细胞核均为完整的圆形，发出均匀明亮的荧光，未发生染色质浓缩。当用药物处理结肠癌细胞24 h后，大部分细胞发生了凋亡，在SW480中尤为明显。视野中可以看到许多细胞核发出的亮蓝色荧光表现出染色质的不均一化，且细胞核形态呈现固缩、不规则、边集、分裂，有的出现典型的“梅花”状的凋亡小体。正常细胞7702则在处理前后细胞核无明显变化。在玉米芯水提物处理后，肠癌细胞系 SW480、SW620、DLD1的凋亡率分别为39.67%、28.33%、12.33%，而正常细胞 HL-7702 的凋亡率仅为6.83%。

3 讨论

目前研究认为，肿瘤细胞增殖的失控可导致肿瘤的发生和发展，细胞的过度增殖是细胞恶变的潜能，也是肿瘤发生及恶化的主要原因［8］。根据1981～2006年间对北美、欧洲、日本抗癌药物市场的分析，就155种临床应用的抗癌药物数据分析显示:47.1%源于未经修饰的天然产物或天然产物的衍生物，或是以天然产物复合物药效基团为基础设计合成的药物［9］。因而，从自然界中寻找发现高效低毒的抗癌活性成分或先导化合物一直是国内外药物学家非常关注的课题和研究的热点［10］。

本文探讨了玉米芯水提物对结肠癌细胞株SW480、SW620、DLD1的增殖作用的影响。研究发现，玉米芯水提物对肠癌细胞的增殖均有明显的抑制作用，且随着药物浓度的增加，对这几种细胞生长的抑制率也增加，呈明显的量效依赖关系。玉米芯水提物对不同的结肠癌细胞株抑制能力不同，其中对SW480细胞抑制能力最强，SW620细胞次之，对DLD1细胞抑制能力较弱。倒置显微镜观察表明，经该水提物处理后的结肠癌细胞，形态发生明显的改变，贴壁细胞明显减少，细胞变圆，大面积脱落。DAPI染色结果显示:细胞核呈“月缺形”，且许多细胞核发出的亮蓝色荧光表现出染色质的不均一化，出现典型的“梅花”状的凋亡小体。接下来我们将进一步对玉米芯水提物的有效成分进行提取和分离鉴定，确定凋亡途径及其作用靶标，并系统研究其在动物体内的作用，为其进一步开发应用奠定基础。

细胞凋亡普遍存在于肿瘤组织细胞中，与肿瘤的发生、发展及退化有着密切的关系［11］。大多数抗肿瘤药物能够诱导敏感肿瘤细胞发生凋亡，其抗肿瘤效果与肿瘤细胞在药物诱导下发生细胞凋亡的活性有关。因此，诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的一个新热点，也是评价疗效的一项重要指标［12］。DAPI作为特异性的荧光探针已被广泛应用于细胞分子生物学等各个领域，DAPI荧光染料可与细胞核内的DNA发生特异性结合，经紫外光激发后，在荧光显微镜下，细胞核会发出明亮的蓝色荧光，以此观察细胞核的形态变化情况。早期凋亡细胞呈现核浓缩，染色加深，或核染色质呈新月形聚集于核膜一边;晚期凋亡细胞表现为核碎裂成大小不等的圆形小体，并被细胞膜所包绕，即凋亡小体。

玉米芯主要是由35% ～40%的半纤维素、32%～36%的纤维素、17% ～20%的木质素及12% ～18%的灰分构成［4］。我们分别测定了玉米芯水提液中蛋白及多糖的含量，结果表明蛋白浓度为0.145 mg/mL，糖含量为23.2 mg/mL。因此推测玉米芯水提取物的有效成份为多糖类。已有的研究报道表明，多糖类物质常具有抗肿瘤活性，它们的抗肿瘤机制主要是通过影响肿瘤细胞膜的通透性、细胞信号传导通路、细胞周期及肿瘤相关基因表达等［13］，而玉米芯水提物及其多糖是通过何种机制发挥其抗肿瘤活性，有效的抑制肠癌细胞的生长还有待进一步研究。

植物提取物被用来治疗人类疾病已有几千年，近年来，许多具有抗氧化性和抗恶性细胞增殖作用的多糖类，如海藻中的硫酸多糖，壳聚糖等均得到分离纯化。这些糖类均有较高的水溶性，且毒性较低，许多已经作为安全的食品制品。因此，将具有抗氧化性和/或抗恶性细胞增殖作用的多糖类开发作为新型的食品添加剂或者抗肿瘤保健品具有深远的意义［14，15］。

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