牛磺酸对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞的保护作用

任素芬 刘学政

Müller细胞是视网膜内最主要的胶质细胞，在调节视网膜光感受器和神经元的功能以及维持血-视网膜屏障的完整性中具有重要作用［1］。视网膜氧化应激导致Müller细胞功能受损是糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)的重要机制之一［2］。研究表明，持续给予牛磺酸可抑制DM大鼠视网膜氧化应激［3］，但牛磺酸抑制DM视网膜应激对Müller细胞的影响尚不完全清楚，因此本研究拟探讨牛磺酸对DR大鼠视网膜Müller细胞的影响及其机制，以期为DR的临床防治提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 材料与仪器 雄性SD大鼠，180～220 g(辽宁医学院实验动物中心)，牛磺酸(北京嘉康源化工有限公司)，还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone，GSH)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(碧云天生物公司)，链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)及谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)抗体(Sigma公司)。

1.2 实验分组 SD大鼠腹腔注射1%的STZ溶液(55 mg/kg，0.1 mol/L柠檬酸缓冲液溶解)，72 h后检测尾静脉血糖浓度＞16.7 mmol/L即为DM模型。牛磺酸溶于0.1 mol/L的PBS缓冲液，实验分为4组，对照组(正常SD大鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液)、DM组(STZ诱导的DM大鼠模型)、牛磺酸组(DM大鼠腹腔注射牛磺酸50 mg/kg，0.5 ml/d)，PBS组(DM大鼠腹腔注射0.1 mol/L的PBS)，3个月后进行下列分子生物学检测。

1.3 视网膜GSH和MDA含量的检测 以10%的水合氯醛麻醉大鼠，剥离视网膜，以生理盐水制成5%组织匀浆，4000 r/min离心取上清液，按试剂盒说明进行操作，根据试剂盒提供公式计算GSH及MDA含量。

1.4 Western blot检测视网膜GFAP及GS蛋白表达 制备视网膜组织匀浆，12000 r/min离心15 min，取上清液 SDSPAGE电泳后转移至PVDF膜上，以GFAP、GS蛋白和β-actin一抗37℃孵育2 h后，用辣根过氧化物酶标记的对应二抗室温孵育1 h，再以增强发光试剂盒显影。

2 结果

2.1 视网膜GSH及MDA含量 与对照组相比，DM组及PBS组视网膜GSH含量明显降低，MDA含量明显增加(P＜0.05)，而牛磺酸组GSH及MDA含量均无明显变化(P＞0.05)(表1)。

表1 大鼠视网膜MDA及GSH含量(x ± s，n=6/组)

2.2 牛磺酸对DM大鼠视网膜GFAP及GS表达的影响 以β-actin为内对照，与对照组相比，DM组及PBS组GFAP表达上调，GS表达明显下调，而牛磺酸组GFAP及GS表达均无明显改变(图1)。

图1 Western blot法检测视网膜GFAP及GS表达变化

3 讨论

Müller细胞占视网膜细胞总数的4% ～5%，约占视网膜胶质细胞90%以上，贯穿于视网膜全层，与视网膜光感受器、神经元、其他类型胶质细胞以及视网膜血管等具有紧密联系，不仅在神经元的营养及兴奋性传递中也发挥重要作用，在维持细胞外环境稳态、调节视网膜微血管通透性以及血-视网膜屏障完整性中页发挥重要作用［1］。

Müller细胞氧化应激导致结构和功能异常是DR的重要原因之一，Müller细胞受损表现为GFAP表达上调［1］。Müller细胞主要位于内核层，其突起布及内界膜至外界膜的整个视网膜，形成广泛的突触联系。本研究发现，DM 3个月时大鼠视网膜GSH含量降低，MDA增加，出现了氧化应激表现，而DM大鼠给予牛磺酸可明显增加视网膜GSH含量，并降低视网膜MDA含量。结果提示牛磺酸可抑制DM大鼠视网膜氧化应激反应。此外，DM大鼠视网膜发生氧化应激的同时GFAP表达上调，牛磺酸抑制DM视网膜应激的同时下调了GFAP表达，实验结果提示DM大鼠视网膜氧化应激导致了Müller细胞受损，而牛磺酸通过抑制氧化应激保护Müller细胞受损。本实验检测了视网膜GS的表达变化，以进一步探讨牛磺酸抑制氧化应激对DM视网膜Müller细胞功能的影响。Müller细胞是视网膜中唯一可以合成GS的细胞，GS可将谷氨酸转运体(glutamate-aspartate trans-porter，GLAST)逆浓度差由细胞外转运至Müller细胞内的谷氨基酸转化为谷氨酰胺，消除谷氨酸堆积所产生的细胞毒性，以防视网膜神经元发生退行性改变［4］。本研究发现，DM大鼠视网膜氧化应激时GS表达下调，而牛磺酸抑制DM大鼠视网膜氧化应激可上调GS表达。结果提示，牛磺酸可能通过上调GS在Müller细胞中的表达促进了谷氨酸转化，在消除谷氨酸堆积的细胞毒性、预防视网膜神经元退行性变以及DR临床治疗中发挥积极作用。

本研究为牛磺酸防治DR提供了思路，但牛磺酸对DM大鼠Müller细胞GLAST的活性及功能的影响尚不完全清楚，在清除DM大鼠视网膜谷氨酸的作用仍有待进一步探讨。

［1］ Grosche A，Pannicke T，Karl A，et al.Physiologic properties of Müller cells from human eyes affected with uveal melanoma.Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53(7):4170-4176．

［2］ 张强，左中夫，刘学政.姜黄素对高浓度葡萄糖培养的RF/6A细胞活力的影响.国际眼科杂志，2012，12(9):1636-1638．

［3］ Di Leo MA，Santini SA，Cercone S，et al.Chronic taurine supplementation ameliorates oxidative stress and Na+K+ATPase impairment in the retina of diabetic rats.Amino Acids，2002，23(4):401-406．

［4］ Ishikawa M，Yoshitomi T，Zorumski CF，et al.Downregulation of glutamine synthetase via GLAST suppression induces retinal axonal swelling in a rat ex vivo hydrostatic pressure model.Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52(9):6604-6616