医疗器械环氧乙烷灭菌的主要考量因素

黄洁 蒋秀红 新合力（苏州）灭菌技术有限公司 (苏州 215125)

0.前言

环氧乙烷（Ethylene Oxide, 简写为EO或EtO, ETO）是一种运用广泛的化学灭菌剂，对细菌、病毒、芽胞、真菌都有较强的灭菌作用，广泛运用于纸张、皮革、木材、金属、塑料、化纤制品等灭菌。环氧乙烷于1859年由Charles Wurtz首次制备，上世纪60年代之前主要用做杀菌剂和熏蒸剂。上世纪60年代随着一次性使用医疗器械的开发和投入使用，开始用于医疗器械灭菌。由于环氧乙烷具有低温灭菌、灭菌范围广、穿透性强等特点，此后在医疗器械灭菌领域发展迅速。目前全球医疗器械的灭菌，大约一半的市场份额由环氧乙烷灭菌占据[1]。

本文简述运用环氧乙烷灭菌技术时，所需要考量的主要因素。

1.灭菌参数

环氧乙烷灭菌的基本原理是环氧乙烷做为强 烷化剂，与微生物的核酸、功能蛋白、酶等的氨基、羧基、羟基、巯基等基团反应，使之发生化学结构上的改变（烷基化），从而影响其生物学活性，阻止微生物细胞的增殖，使细胞死亡。做为化学反应，灭菌的反应速率与反应物浓度、温度等因素有关。以下对影响环氧乙烷灭菌效果的主要因素如温度、浓度、湿度、灭菌时间等因素做简要介绍。

1.1 灭菌温度

由于环氧乙烷灭菌为化学反应，其反应速率与温度相关，通常为定量讨论，定义其温度系数Q10（Temperature Coefficient）为温度每升高10˚C后，反应速率除以原反应速率的比值。Charles R. Phillips在1949年发现环氧乙烷灭菌过程中，Q10为2.74，即灭菌温度升高10度，反应速率为原来的2.74倍[2]。后续其他学者的研究表明，该结论可能过于简单。Ernst和Schull之后测得的Q10为1.8，且其研究显示，Q10随浓度变化而变化，但永远大于等于1.8[3]。其他人也做了相似的研究，测得的数据都在1.8至2.74之间[4]。

这些研究为定量分析温度对环氧乙烷灭菌的影响奠定基础。在实际的灭菌过程中，常以1.8～2.74这一范围的Q10值来估算调整灭菌温度对灭菌效果的影响。进一步简化的估算方法是：温度每提高10˚C，灭菌效果加倍。

就环氧乙烷灭菌的工业运用而言，并非温度越高越好，一方面是考虑到产品对温度的耐受性，另外过高温度要求会增加灭菌设备成本上的投入，因此最常见的灭菌温度为50˚C左右。

1.2 环氧乙烷浓度

大体上环氧乙烷灭菌符合一级动力学，即随着反应浓度的增加，化学反应速率呈线形提高。然而研究发现存在着一个浓度限度，当环氧乙烷浓度大于此限度时，灭菌反应服从零级动力学，具体表现为：进一步提高环氧乙烷浓度对反应速率基本无影响。

Ernst和Schull的研究表明，在37˚C以上、环氧乙烷浓度大于884mg/l时，环氧乙烷灭菌为零级反应[3]。因此将此原理运用于工业灭菌，通常做法是适当增加环氧乙烷浓度，最常见的灭菌浓度为600mg/l左右，既不使反应浓度过低影响灭菌效果，也不无谓提高浓度增加成本。

实际灭菌过程中，对于浓度的计算有如下两种方法：

a) 重量法

式中：

W为注入的环氧乙烷重量；

V是灭菌柜体积（空柜体积）；

b) 理想气体状态方程法(Ideal Gas Law)。

对理想气体状态方程进行转换，可得到以下环氧乙烷气体浓度计算公式：

式中：

K为纯环氧乙烷气体的常数，其值为4.4×104；

P为EO注入过程的压力差；

R为气体常数，其值为0.08314；

T为灭菌柜温度（开式温度）。

以上两种计算方法跟实测数据均有差异，尤其是重量法，多数情况下差异更大。因此有条件的话可在灭菌柜内安装可实时监控EO浓度的传感器，能获得准确的实际浓度数据，且能得出EO浓度随灭菌时间变化的关系，合理设计灭菌过程。

1.3 灭菌时间

灭菌过程作为微生物消亡的过程，符合指数规律，即灭菌过程中，微生物数量的对数值与灭菌时间呈线形相关。目前确定灭菌时间的最常见方法是过度杀灭法中的半周期法(Half-cycle Approach)[6～7]。即以能使生物指示剂（BI）/工艺调整器械（PCD）全部杀灭的灭菌周期为基础，将其定为半周期。三次半周期均取得满意结果后，将灭菌时间至少延长一倍，得到全周期。

其理论基础为：半周期中由于BI的生物负载大于106, 当BI全部杀灭时，其对数下降值（Spore Log Reduction, SLR）≥6，生物负载由106降至100以下；当灭菌时间加倍后（全周期），生物负载进一步由100降至10-6（实际上由于没有活菌，此时并无存活微生物，只有微生物存活的几率）。这样即达到医疗器械通常意义上的无菌（无菌保证水平Sterility Assurance Level达到10-6）。

除了半周期法之外，ISO 11135-1:2007也列出了其他允许的方法如BI/生物负载法（Biological Indicator/Bioburden Approach）等，详情可参见ISO 11135-1:2007的附录A、附录B以及ISO/TS 11135-2:2008的附录A、附录B。

1.4 湿度

湿度在环氧乙烷灭菌过程中起重要作用，通常认为湿度的作用有两方面，一方面，环氧乙烷与脱水的细菌芽胞反应需要有一定的水分；另一方面，水能增强环氧乙烷的穿透性，使之更容易透过医疗器械的包装。

湿度有露点、相对湿度等表示方法，通常环氧乙烷灭菌中采用相对湿度。实验室中的研究表明30%以上的相对湿度对灭菌过程即已充分，但考虑到工业灭菌中，穿透到产品包装（如初包装、立方袋、中盒、大箱、托盘缠绕膜）内的相对湿度会有损失，工业上通常采用60%左右的相对湿度对产品进行处理。

在灭菌柜内没有装湿度传感器的情况下，可用以下公式计算灭菌柜内的相对湿度：

式中：

Pw为注入的蒸气分压；

Pi为蒸气注入前灭菌柜内的蒸气分压；

Pss为灭菌温度下的饱和蒸汽压。

通过上述公式计算出的相对湿度是一个理论值，跟实际的灭菌湿度有时会有较大差异。

由上述1.1及1.4部分可以看出，环氧乙烷灭菌过程中，产品温度和湿度能显著影响灭菌效果。而产品温度和湿度受季节因素影响，特别是在冬季，由于温度较低、空气干燥，对产品灭菌尤为不利。因此工业化环氧乙烷灭菌大多设有预处理（Preconditioning）这一工艺过程。通过将产品置于预处理室中，对其升温加湿，使产品在进入灭菌柜前即达到较理想的温湿度水平。如此可使灭菌时间缩短，提高灭菌效率。

2.产品放行与生物指示剂

环氧乙烷灭菌产品的放行方式主要有两种：传统放行和参数放行，这两种产品放行方式的灭菌确认中都需要用到生物指示剂（Biological Indicator, BI）, 以下对这两种放行方式及生物指示剂做简单介绍。

2.1 传统放行 (Conventional Release)

传统放行是结合灭菌参数审核和BI检测结果进行产品放行的方式，这是目前国内外采取的最主要方式，为各国监管机构所接受。环氧乙烷灭菌的工艺参数非常之多，当出现轻微、不影响灭菌效果工艺偏差时，BI检测结果能为是否放行产品提供微生物学依据。

传统放行的缺点是BI培养需要7天，可能会延长产品周转时间，另外BI本身及其检测也需要一定的成本或者产生部分费用。

在灭菌确认方面，ISO 11135-1:2007规定需要定期进行再确认，但对于“定期”的频率并未做硬性规定，ISO/TS 11135-2:2008建议至少每两年进行一次再确认。

2.2 参数放行 (Parametric Release)

参数放行是指基于灭菌参数审核进行产品放行的方式，由于免除了BI检测，具有产品周转快、放行成本低等优势。但是由于缺乏BI检测结果这一微生物学支持，当出现灭菌工艺偏差时，灭菌批被拒收的概率随之加大。如果是不能重复灭菌的产品，其质量风险非常之高，所以通常采用参数放行的产品，至少能经受两次环氧乙烷灭菌而不影响产品性能或包装，且重复灭菌后的残留水平亦能符合限度标准。

参数放行对灭菌设备提出了更高的要求，与一般设备相比，还需要：

a) 灭菌柜中有两个在不同位点安装的温度传感器；b) 灭菌柜中有能直接读取相对湿度的传感器；c) 灭菌柜中有能直接读取环氧乙烷浓度的传感器。

在灭菌确认方面，ISO 11135-1:2007规定参数放行的再确认必须每年进行一次。

另外特别需要指出的是，并非所有医疗器械的监管机构都认可参数放行这一产品放行方式，例如我国医疗器械监管机构还未接受参数放行。

2.3 生物指示剂（BI）

生物指示剂（BI）是环氧乙烷灭菌的必需品。即使是无需进行BI检测的参数放行，其初始灭菌确认和年度再确认也需要采用BI，以证明达到所需的无菌保证水平（SAL）。

环氧乙烷灭菌中所用的BI，一般为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）或证明有同等抗性的其他菌株，孢子计数不得低于106，抗性要求为54˚C条件下D值≥2.5min，和/或30˚C条件下D值≥ 12.5min[8～9]。ISO 11138-1:2006和 ISO 11138-2:2009对环氧乙烷灭菌中所用的BI有较为详细的规定。

灭菌后，BI的培养时间通常为7天，对于某些产品而言，这一时间可能过长，影响产品放行。缩短培养时间可以通过RIT （Reduced Incubation Time）研究来确认，具体方法为：将100个BI经亚致死周期灭菌，之后比较1～7天的阳性率，以第7天阳性率为基准，达到其97%水平的天数即为经确认的培养天数。使用该方法时FDA有许多建议的要点，如：

a) 亚致死周期中，阳性率应在30%～80%之间；

b) 至少3个亚致死周期；

c) BI至少3个批号，每个批号至少100个；

d) BI取出后8h内必须测试；

e) BI培养时间至少为7天。

3.环氧乙烷残留量

环氧乙烷通常被认为是一种低残留量的灭菌剂，但其在某些产品上可能在灭菌后有一定量的残留EO（环氧乙烷）、ECH（2-氯乙醇）以及EG（乙二醇）。

ISO 10993-7:2008 是目前国际上常用的规定环氧乙烷残留量限度的主要标准，ISO 10993-7:2008指出：当EO和ECH均符合限度时，EG的风险较小[10]。因此目前主要检测EO和ECH两种残留物质。

对于在我国市场销售的产品，我国GB15980-1995 规定EO限度不得超过10µg/g[11]，因此内销的一次性使用医疗用品需要符合这一限度标准。

降低EO以及ECH、EG残留量的主要工艺方法是通风，含常温通风和强制通风两种。由于常温通风受季节因素影响大，目前国际上的主流方法是强制通风。即在维持一定的温度和换气次数的情况下通风。单位时间内的换气次数越多，解析温度越高，通风效果也越好。

ISO 10993-7:2008指出，对大多数产品而言，产品中的EO残留量的对数值，与产品的通风时间呈线形相关。该方法可用来建立EO释放曲线，计算EO残留量达标所需的通风时间。

4.产品设计

采用环氧乙烷灭菌的医疗器械，在产品设计和确认阶段即应充分考虑灭菌因素。第一，产品包装应为透气包装，原因是：a) 有利于EO、水蒸气、热量等穿透至灭菌部位；

b) 有利于灭菌残留物（EO、ECH、EG）快速从产品中逸出；

c) 有利于包装和产品完整，比如透气性不充分的包装可能会在压力变化下爆裂开口。

第二，产品的组成材料应能经受环氧乙烷灭菌，且不易吸附大量的灭菌残留物。

第三，产品的构造、折叠方式等等应有利于气体流通，如果产品内部有闭合区，灭菌难度会大大增加。

第四，产品装载模式应有利于灭菌剂穿透，经确认的装载模式应予以规定，不能随意更改。如果产品是堆载在托盘上，带着缠绕膜灭菌，则缠绕膜的形式也应经过确认，不得随意更改。

第五，产品的材料、生产包装工艺等应有利于将产品初始污染菌控制在较低的水平，内销产品应符合GB15980-1995中关于初始污染菌的相关要求。

另外，一般建议在产品设计和确认阶段，即考虑将来常规灭菌中偶尔失败，需要将产品重新灭菌的可能性。由于重复灭菌可能会带来更高的残留物水平、对产品性能和包装影响更大，为确认重复灭菌的可行性，通常将产品经过两次或多次全周期灭菌，然后检测产品性能、包装性能、灭菌残留物水平，确定允许的灭菌次数。

5.结语

综上所述，运用环氧乙烷对医疗器械灭菌需要考虑到灭菌参数、灭菌残留、产品设计等诸多因素，较其他灭菌方式如辐照等更为复杂。自上世纪中期以来，大量的实验室研究和工业应用，使得医疗器械的环氧乙烷灭菌日趋成熟和完善，成为全球范围的主流灭菌方式之一。本文对该领域的理论基础和实际运用做了一个简要的归纳，希望能对感兴趣的读者有所帮助。

[1]新合力集团内部培训材料

[2]Charles R. Phillips, The sterilization action of gaseous ethylene oxide, II. Sterilization of contaminated objects with ethylene oxide and related compounds: time, concentration and temperature relationships, Am. J. Hyg., 1949, Vol 50: pp.280-288.

[3]Robert R. Ernst and James J. Shull, Ethylene oxide gaseous sterilization, I. Concentration and temperature effects, Appl Microbiol. 1962 July; 10(4): 337-341

[4]Gisela C. C. Mendes, Teresa R. S. Brandão, and Cristina L. M. Silva, Etheylene oxide sterilization of medical devices: A review, Am J Infect Control. 2007 Nov; 35(9):574-81

[5]AAMI TIR15:2009 Physical aspects of ethylene oxide sterilization

[6]ISO 11135-1:2007 Sterilization of health care products – Ethylene oxide – Part 1: Requirements for development, validation and routine control of a sterilization process for medical devices

[7]ISO/TS 11135-2:2008 Sterilization of health care products – Ethylene oxide – Part 2: Guidance on the application of ISO 11135-1

[8]ISO 11138-1:2006 Sterilization of health care products – Biological indicators – Part 1: General requirements

[9]ISO 11138-2:2009 Sterilization of health care products – Biological indicators – Part 2: Biological indicators for ethylene oxide sterilization processes

[10]ISO 10993-7:2008 Biological evaluation of medical devices – Part 7: Ethylene oxide sterilization residuals

[11]GB15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准