甘肃裕固族人群血脂水平与ApoB基因多态性的关系

寇 炜 兰咏梅 李培强 刘金英 周云松 (西北民族大学医学院，甘肃 兰州 730030)

高脂血症(HI)是冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)、脑梗死、心肌梗死等疾病的重要危险因素，高脂血症发病受遗传和环境等因素影响。研究证实多种载脂蛋白(APO)基因的多个位点变异均对血脂水平有一定的影响，临床流行病学调查则显示在不同地区、不同人群中的研究结果不尽相同〔1〕。载脂蛋白B(ApoB)是血浆乳糜微粒，极低密度脂蛋白及低密度脂蛋白(LDL)的主要蛋白质，它与血浆胆固醇和甘油三酯的运输与代谢密切相关，在调节LDL分解代谢及血浆胆固醇水平中起主要作用。大量流行病研究表明，血浆胆固醇和ApoB水平升高是发生动脉粥样硬化和冠心病的主要危险因素〔2〕。目前，中国人群血脂异常的现状不容乐观，鉴于血脂异常发生率高，危害严重，本文选择ApoB基因的rs676210位点，以甘肃省特有少数民族裕固族人群为研究对象，采用MALDI-TOF的方法观察其与血浆脂质水平的相关性，从分子水平探讨ApoB基因在高脂血症中发生发展中的作用，为血脂异常及相关疾病的防治提供帮助。

1 对象与方法

1.1 研究对象 采用整群抽样方法，将聚居于甘肃肃南地区裕固族自治县境内的裕固族居民464人作为研究对象，男233人，女231人;病例组(224人)，健康体检者(240人);年龄38～70岁，平均年龄(42.18±13.49)岁。受试者均签署知情同意书。

1.1.1 血脂异常诊断标准〔3〕TC≥5.72 mmol/L为高胆固醇血症，TG≥1.70 mmol/L为高甘油三酯血症，LDL-C≥3.64 mmol/L为高低密度脂蛋白血症，HDL-C≤0.91 mmol/L为低高密度脂蛋白血症。

1.1.2 排除标准 纯合子家族性高胆固醇血症或药物引起的高脂血症者;妊娠妇女、哺乳期妇女;半年内曾患急性心肌梗死、脑血管意外、严重创伤或重大手术者;肾病综合征或肾功能不全、甲状腺功能减退、严重高血压、急性或慢性肝、胆、胰疾病、糖尿病、过敏体质及急性炎症期患者及有严重烟、酒嗜好者。

1.2 研究方法

1.2.1 试剂和仪器 DNA试剂盒为上海中能生物技术公司提供，全自动生化分析仪分析为Beckman CX4 Pro，质谱仪为美国ABI公司的MALDI-TOF 4700。

1.2.2 标本收集 所有被检者空腹12 h以上，次日清晨抽取空腹静脉血，一管用EDTA-K2抗凝，供提取基因组DNA用;另一管肝素抗凝，现场离心后，置－20℃保存。

1.2.3 血脂检测 采用全自动生化分析仪分析检测TC、TG、HDL-C、LDL-C，所有上述指标检测均由西北民族大学医学院中心实验室完成。

1.2.4 APOB基因位点多态性检测

1.2.4.1 样品制备 采用血液基因组DNA小量抽提试剂盒，从血液中抽提白细胞基因组DNA，－20℃保存。

1.2.4.2 质谱分析 取1 μl上清液点置于MALDI样品靶上，晾干，点1 μl基质溶液，再晾干备用。Smart Beam激光器，波长355 nm，每个样品谱图累积500个激光脉冲信号，质量范围(m/z)220 kD，延迟提取时间200 ns，加速电压20 kV，提取电压18.6 kV，聚焦电压6.5 kV。每个样品测定15张蛋白质量图谱，然后提取特征峰信息，以获得可靠均值，采用Mass ARRAY system(Sequenom，San Diego，CA)方法进行多态性分析。此外，基因型分析的操作人员不知道所检测标本的病例或对照属性(上述质谱分析过程在深圳华大基因科技有限公司完成)。

2 结果

2.1 高脂血症组和健康对照组的血脂水平比较 经χ2检验表明，ApoB基因rs676210基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。表明本研究人群APOB基因rs676210基因型分布已达到遗传平衡，具有群体代表性。见表1。

表1 高脂血症组和健康对照组的血脂水平比较(±s)

表1 高脂血症组和健康对照组的血脂水平比较(±s)

与健康对照组比较:1)P＜0.01，2)P＜0.05

组别 n 年龄(岁) 男/女 TC(mmol/L) TG(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C(mmol/L)高脂血症组 224 53±16 142/80 6.53±0.401) 2.29±0.401) 3.69±0.321) 1.82±0.302)健康对照组 240 50±13 124/116 4.35±0.36 1.24±0.34 2.85±0.35 1.58±0.27

2.2 两组各基因型及等位基因频率比较 ApoB基因rs676210各基因型在两组人群中的分布差异有显著性(P＜0.05);等位基因频率在两组人群中的分布差异也有显著性(P＜0.001);等位基因频率的相对风险分析发现，rs676210位点G等位基因携带者患高脂血症组的风险是A等位基因的5.583倍(OR=1.641，95%CI=1.086～2.479)。见表2。

表2 高脂血症组和健康对照组rs676210位点基因型和等位基因频率的比较〔n(%)〕

2.3 ApoB基因的rs676210基因多态性对血脂代谢的影响在高脂血症组中，AG及GG基因型者的TC水平明显高于AA型(P＜0.01)，AG、GG基因型HDL-C水平明显低于AA型(P＜0.05);在健康对照组中，各基因型的各项血脂指标均未见差异(P＞0.05)。见表3。

表3 高脂血症组和对照组不同基因型及等位基因血脂水平比较(±s，mmol/L)

表3 高脂血症组和对照组不同基因型及等位基因血脂水平比较(±s，mmol/L)

与健康对照组比较:1)P＜0.01，2)P＜0.05

组别AA AG GG高脂血症组n 74 110 40 TC 6.21±0.22 6.67±0.481) 6.74±0.541)TG 2.27±0.38 2.29±0.40 2.31±0.46 LDL-C 3.71±0.36 3.68±0.32 3.67±0.33 HDL-C 1.96±0.37 1.75±0.232) 1.76±0.232)健康对照组n 130 86 24 TC 4.34±0.32 4.39±0.40 4.37±0.38 TG 1.22±0.33 1.24±0.34 1.26±0.35 LDL-C 2.83±0.31 2.88±0.33 2.84±0.35 HDL-C 1.59±0.29 1.58±0.27 1.57±0.26

3 讨论

ApoB基因位于人类第2号染色体p23-24，全长43 kb，含有28个内含子和29个外显子〔4〕，有显著差异和明显的多态性，是LDL和VLDL中主要的载脂蛋白，对维持体内血脂水平的恒定具有重要作用。ApoB基因与其他载脂蛋白的结构相比较有显著的差异，存在多个遗传突变位点，已被认为是促使动脉粥样硬化(AS)与冠心病(CHD)的危险因子〔5〕。有调查显示，心血管病已经成为我国城市和乡村人群的第一位死亡原因〔6〕，在经济发展较快的大城市，缺血性脑卒中发病率明显升高〔7〕，预示以AS为基础的缺血性心血管病(包括CHD和缺血性脑卒中)发病率正在升高。为此，对血脂异常的防治必须及早给予重视。

ApoB基因的一个或几个位点的微小变异或缺陷都会引起个体血脂增高，最后导致AS或CHD。ApoB基因多态性与血浆脂质水平，AS和CHD的关系，国外已有不少报道，但结果不完全一致，且大多以西方高加索人种为研究对象〔8～11〕。Kathiresan等〔12〕研究发现LDL水平升高、HDL水平降低及TG水平是心血管疾病重要的独立危险因素，并发现ApoB基因rs693位点的A等位基因与LDL及TG水平的升高相关。Rebhil〔13〕对北非人的研究亦发现ApoB基因5'Ins/Del和3'vNTR多态性影响血脂水平，增加CHD易感性。苏上贵〔14〕等报道广西壮族和汉族人之间存在差异，E+等位基因是广西汉族人群CHD的易感基因，而对广西壮族人群无影响。另国外对白人的研究发现，英美白人与挪威白人之间E+等位基因与血脂和CHD的相关性也存在显著的不一致性〔15〕。国内外研究均显示ApoB基因多态性与血脂代谢及CHD相关联，但群体不同得到的关联程度不同，可能是不同群体和民族的关联表现在不同的遗传背景和环境背景。

目前，在人类ApoB基因已发现多个位点与血脂水平和心脑血管病相关，而本研究中所涉及的rs676210位点单核苷酸多态性在国内还未见报道。本研究发现对于裕固族人群来说，高脂血症组AA、AG和GG基因型的频率与健康对照组相比差异显著。同时，在高脂血症组中，AG及GG基因型者的TC水平明显高于AA型，AG、GG基因型HDL-C水平明显低于AA型。而风险分析显示G等位基因是高脂血症的一个独立危险因素，rs676210位点G等位基因的携带者其风险性较高，因此笔者推测ApoB基因的rs676210位点的AG及GG基因型和G等位基因携带者具有高脂血症易感性，与高脂血症患者的血脂水平升高存在关联性，可能是裕固族人群高脂血症的易感基因。

总之，本研究初步从分子基因水平对甘肃省肃南地区裕固族人群ApoB基因多态性与高血脂的相关性进行了分析，从基因水平寻找血脂代谢紊乱的危险因素，筛选血脂代谢紊乱的易感基因，可以为脂代谢紊乱个体的遗传危险度评价提供重要依据，为脂代谢紊乱及其相关的心血管疾病的预防提供可行的手段，并可为它们的治疗提供新思路，因而对预防、筛选及早期诊治这些人群血脂异常具有一定的基础和临床意义。

1 Ikewaki K，Matsunaga A，Han H，et al.A novel two nueleotide deletion in the apolipoprotein Al gene，apoAI Shinbashi，associated with high density lipoprotein deficieney，eomealo Pacities，Planar xanthomas，and premature coronary artery disease〔J〕.Atherosclerosis，2007;172(l):39-45.

2 国家“九五”科技攻关课题协作组.我国中年人群心血管病主要危险因素流行现状及从80年代初至90年代末的变化趋势〔J〕.中华心血管病杂志，2001;29:74-9.

3 中国成人血脂异常防治指南制订联合委员会.中国成人血脂异常防治指南〔J〕.中华心血管病杂志，2007;35(5):390-419.

4 Ludwig EH，Blackhart BD，Pierotti VR，et al.DNA sequence of the human apolipoproteinB gene〔J〕.DNA，1987;6(4):363-8.

5 Machado M，Hirata MH，Bertolami MC，et al.Apolipoprotein B gene type is associated with lipid profile of higher risk for coronary heart disease in Caucasian Brazilian men〔J〕.J Clin LabAnal，2001;15(1):19-24.

6 中华人民共和国卫生部.2006中国卫生统计年鉴〔M〕.北京:中国协和医科大学出版社，2006:102-31.

7 王文化，赵 冬，吴桂贤，等.北京市1984～2002年人群脑卒中发病率变化趋势〔J〕.中华流行病学杂志，2003;22:269-72.

8 Humphries SE.DNA polymorphisms of the apolipoprotein genes their use in the investigation of the genetic component of hyperlipidaemia and atherosclerosis〔J〕.Atherosclerosis，2001;72:89-92.

9 Aburatani H，Murase T，Takakn F，et al.ApolipoproteinB gene polymorphisms and myocardial infarction〔J〕.NE J Med，2006;317(5):52-8.

10 Myant NB，Gallagher J，Barbir M，et al.Restriction fragment length polymorphisms in the Apo B gene in relation to coronary artery disease〔J〕.Atherosclerosis，2005;77:193-9.

11 Paulweber B，Friedl W，Krempler F，et al.Association of DNA polymorphism at the apolipoprotein B gene locus with coronary heart disease and sermvery low density lipoprotein level〔J〕.Arteriosclerosis，2000;10:17-22.

12 Kathiresan S，Melander O，Guiducci C，et al.Six new loci associated with blood low，density lipoprotein cholesterol，high-density lipoprotein cholesterol or triglyecrides in humans〔J〕.Nat Genet，2008;40(1):189-97.

13 Rebhil，Omezzine A，Kehok K，et al.5'Ins/Del and 3'vNTR Polymorphisms in the apolipoproteinB gene in relation to lipids and coronary artery disease〔J〕.Clin Chem Lab Med，2008;46(3):329-33.

14 苏上贵，覃甲仁，韦玉兰.广西地区壮、汉族人群载脂蛋白B基因多态性及其与冠心病的关系〔J〕.广西医科大学学报，2003;20:858-61.

15 Boekholdt SM，Peters RJ，Fountoulaki K，et al.Molecular variation at the apolipoproteinB gene locus in relation to lipids and cardiovascular disease:a systematic meta-analysis〔J〕.Hum Genet，2003;113(5):417-25.