磷酸肌酸后处理联合缺血后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤

张会珍 邢艳秋 章 萌 肖 冬 王 慧 寇学俊

(山东省医学科学院基础医学研究所，山东 济南 250062)

急性心肌梗死早期溶栓以及后来的PCI作为再灌注治疗方法的引进，已经一定程度上降低了发病率和死亡率〔1〕。但它致命的缺点就是在再灌注时由于大量血流的快速恢复同时伴有大量自由基等的产生，造成了缺血再灌注损伤，如何更好地提高介入等再灌注的效果，减轻再灌注损伤成为目前研究的方向。缺血后适应作为一种创新的治疗策略能够有效地减轻心肌再灌注损伤，但它潜在的缺点是由于再灌注过程中反复的缺血损害了缺氧ATP的产生〔2〕。磷酸肌酸(Pcr)是一种高能磷酸化和物，Prabhakar等〔3〕研究显示应用外源性Pcr可以提高再灌注心肌内的ATP水平。两者联合能不能更好地起到保护作用及其机制如何，目前国内外尚未见报道。本研究探讨Pcr后处理联合缺血后处理在大鼠缺血再灌注损伤的心肌保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康、雄性、清洁级Wistar大鼠65只，体重260～290 g，购自山东大学实验动物中心。

1.2 主要设备及试剂 小动物呼吸机、离心机、心电图机、酶标仪等均由由山东大学教育部、卫生部心血管重构与功能研究重点实验室提供。伊文思蓝、TTC购于美国Sigma公司。肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒均购于南京建成生物工程有限公司。BCA蛋白浓度试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。Pcr(里尔统)购于意大利阿尔法韦士曼制药公司。

1.3 大鼠心肌缺血再灌注模型的建立 方法参照文献〔4〕。腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，行气管切开后连接小动物呼吸机进行机械通气，分离肌层，沿胸骨左缘切开第3、4肋间，开胸器撑开胸腔，剪开心包，暴露心脏，在左心耳根部下方2 mm处穿入7-0丝线，结扎左冠状动脉前降支(LAD)，同时将一内径1.5 mm的乳胶管至结扎线和LAD之间，拉紧结扎线使乳胶管压迫LAD，造成急性心肌缺血。缺血30 min后，拔出乳胶管，冠状动脉再通，形成再灌注。实验中以左室前壁发绀及心电图标、Ⅱ导联ST段抬高为心肌缺血成功标志。冠状动脉阻塞之前经尾静脉应用300 U/kg肝素钠抗凝。

1.4 分组及给药方法 建模过程中死亡5只，成模Wistar大鼠编号按抽签法随机分为4组(n=10)，均予心肌缺血30 min，再灌注120 min处理:(1)Sham组，冠状动脉只穿线不结扎;(2)I/R组，缺血30 min后直接再灌注;(3)IPost组，再灌注前给予3次再灌注10 s/缺血10 s处理;(4)Pcr+IPost组，再灌注前5 min尾静脉缓慢推注Pcr 200 mg/kg，再灌注前同时予3次再灌注10 s/缺血10 s处理。Sham组、I/R组、IPost组分别给予等量生理盐水。

1.5 血清CK、LDH、MPO活性测定 于再灌注2 h末，分离股静脉取血2 ml，3 000 r/min离心15 min，取上清于 －80℃保存待测。CK、LDH及MPO活性测定操作参照试剂盒说明书。

1.6 心肌组织SOD、MDA检测 实验结束时取缺血区心肌组织100 mg制成10%组织匀浆，BCA法测定蛋白浓度，硫代巴比妥酸比色法测定心肌MDA含量，黄嘌呤氧化酶比色法测定心肌SOD活性，操作参照试剂盒说明书。

1.7 心肌梗死范围测量参照文献〔5〕实验结束后，原位结扎冠状动脉，经左心室注入1%的Evans蓝2～3 ml，将非缺血心肌染成蓝色，从而显示出缺血危险区(AAR)心肌。10%KCl处死动物，立即摘取心脏，以预冷生理盐水冲洗残留血。去除大血管、心房及右心室，－20℃冷冻10 min，沿左心室(LV)长轴横切为3～4片厚约2 mm的心肌片，仔细分离蓝染非缺血区和无蓝染缺血区。将无蓝染缺血区心肌置于1%TTC磷酸缓冲液中，于37℃孵育15 min，此时坏死区(AN)呈灰白色，非坏死心肌被染成砖红色。最后将切片置于10%甲醛中固定15 min，在显微镜下仔细将AN心肌及非梗死AAR心肌分开。将分离好的心肌组织分别称重，心肌缺血面积以缺血区心肌重量/左室重量(AAR/LV)来表示，心肌梗死面积以坏死区心肌重量/缺血区心肌重量(AN/AAR)来表示。

1.8 统计学分析 采用SPSS16.0统计软件。计量资料以±s表示。多组均数及组间两两比较分别采用单因素方差分析和最小显著差异法(LSD法)。

2 结果

2.1 各组血清CK、L DH、MPO活性变化 IPost组、Pcr+IPost组较I/R组 CK、LDH、MPO活性显著降低(P＜0.05);Pcr+IPost组与 IPost组相比，CK、LDH、MPO活性显著降低(P＜0.05);Pcr+IPost组与 Sham组相比，CK、LDH、MPO活性升高(P＜0.05)。见表1。

表1 各组血清CK、LDH、LDH活性(n=10，±s，U/L)

表1 各组血清CK、LDH、LDH活性(n=10，±s，U/L)

与Sham组比较:1)P＜0.05;与I/R组比较:2)P＜0.05;与IPost组比较:3)P＜0.05;表2同

组别2.85±0.52 1 138±98 81.95±4.13 I/R组 16.42±2.741 5 329.3±344.691 455.80±18.451 IPost组 8.74±1.192) 2 848.5±137.102) 249.32±23.62)Pcr+IPost组 5.79±1.341)2)3)1 830.7±180.511)2)3)147.43±16.961)2)3)CK LDH MPO Sham组

2.2 各组心肌组织MDA、SOD检测 IPost组、Pcr+IPost组较I/R组MDA显著降低，SOD显著增高(P＜0.05);Pcr+IPost组与IPost组相比，MDA显著降低，SOD显著增高(P＜0.05);Pcr+IPost组与Sham组相比，MDA升高，SOD降低(P＜0.05)。见表2。

表2 各组心肌组织SOD、MDA(n=10，±s)

表2 各组心肌组织SOD、MDA(n=10，±s)

组别 SOD(U/mgprot) MDA(nmol/mgprot)70.22±7.84 1.37±0.13 I/R组 38.96±3.691 5.65±0.741 IPost组 50.08±3.331)2) 2.95±0.371)2)Pcr+IPost组 64.05±4.171)2)3) 1.82±0.21)2)3)Sham组

2.3 心肌缺血及梗死面积比较 各组大鼠间体重、LV重量均无统计学差异。假手术组未见明显缺血及梗死区，其余各组间缺血危险区面积(AAR/LV)均无统计学差异。Sham组大鼠心肌梗死面积显著小于 I/R组、IPost组、Pcr+IPost组(P＜0.05)，IPost组、Pcr+IPost组心肌梗死面积小于I/R组(P＜0.05)，Pcr+IPost组小于 IPost组(P＜0.05)。见表3。

表3 各组心肌梗死面积(n=10，±s)

表3 各组心肌梗死面积(n=10，±s)

与I/R组比较:1)P＜0.05;与IPost组比较:2)P＜0.05

组别 体重(g) LV(g) AAR/LV(%)AN/AAR(%)278.2±3.34 0.79±0.02 43.74±2.13 61±3.88 IPost组 280.8±11.12 0.80±0.05 42.62±1.22 43.27±2.671)Pcr+IPost组 275.2±8.56 0.78±0.03 41.85±1.17 35.52±1.331)2)I/R组

3 讨论

缺血后处理作为一种创新的治疗策略由Zhao等〔6〕2003年首次提出，通过短暂的再灌注、再阻塞可以使心肌梗死面积降低，降低室性心律失常，改善心功能。本研究在体大鼠的缺血再灌注模型上观察了缺血后处理可以减少心肌梗死面积，减轻心肌缺血再灌注损伤。缺血后处理使血清CK、LDH活性的降低进一步证实了其缩小心肌梗死面积的作用。

Ten等〔7〕在基因敲除的Pcr缺乏的小鼠动物模型中研究发现，一个完整的Pcr/Pcr系统在急性应激情况下是非常必要的。Pcr对再灌注心肌的良好保护作用，它与缺血后处理联合起到了协同效果。

Pcr的心肌保护作用机制目前还没有完全了解，Zhao等〔8〕研究显示，Pcr对体外细胞色素C诱导的细胞凋亡有抑制作用，国内刘瑛琪等〔9〕也研究发现应用外源性的Pcr可以抑制心肌细胞凋亡，阻止线粒体跨膜电位的下降，间接的提示抑制线粒体膜通透转换孔的开放，具体抑制其开放的机制目前还不是很清楚。本研究显示缺血后处理可以减低大鼠心肌SOD的活性，提高MDDA的活性，在此基础上加用外源性Pcr可以进一步降低心肌SOD的水平，提高MDA的水平，而SOD是体内氧化代谢过程中产生的超氧阴离子自由基清除剂，其活力的高低能反映机体抗氧化防御水平，SOD活力下降可导致脂质过氧化的最终产物MDA含量升高，因MDA是一个稳定的脂质过氧化物，它的高低可反映脂质过氧化程度，由此可以推测应用外源性Pcr有意义地抑制了氧自由基的产生，提供了对细胞和细胞器膜的抗氧化保护作用。因线粒体膜通透转换孔的开放与钙离子、氧自由基、中性pH值的快速恢复和ATP的耗竭密切相关〔10〕。由此推测Pcr可能通过抑制氧自由基的产生和脂质过氧化保护心肌线粒体，阻止线粒体膜通透转换孔的长时间开放，它与缺血后处理联合发挥了很好的协同作用。

MPO作为中性粒细胞嗜天青颗粒中主要存在的酶，它的高低可反映中性粒细胞的浸润程度。本研究显示，再灌注心肌血清MPO活性明显升高，经过缺血后处理该指标明显下降，显示了缺血后处理抑制炎症反应的作用，加用外源性Pcr后MPO又进一步明显下降，由此推测Pcr在再灌注心肌的保护作用可能与抑制中性粒细胞的聚集，从而减轻炎症反应，从而减轻了心肌组织的坏死。

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8 Zhao Y，Lu Z，Wu M，et al.Effects of phosphocreatine on apoptosis in a cell-free system〔J〕.J Biol Chem，2001;276(37):34573-8.

9 刘瑛琪，任艺虹，李天德，等.磷酸肌酸保护心肌细胞线粒体功能机制初探〔J〕.军医进修学院学报，2004;25(1):15-7.

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