人工关节感染翻修术后近期细菌学研究*

丛锐军 符培亮 刘伟 李晓华 吴海山 吴宇黎 赵辉 王波

（第二军医大学长征医院骨科，上海200003）

人工关节置换术后感染是灾难性并发症，可导致手术失败，患者可能需要移除假体甚至截肢，带来巨大的精神和经济负担。1个月内的急性感染采用保留假体、清创、使用抗生素治疗的手术成功率为26%～70%[1,2]，而慢性感染需二期翻修[3-6]，二期翻修是感染治疗的金标准[7-10]，原则是彻底清除所有异物，全身使用抗生素，局部使用抗生素骨水泥间置器，感染临床治愈后植入翻修假体，术中行冰冻切片。对于两次手术时间、两种手术方式及抗生素骨水泥间置器的类型均存在争议[11-14]。此外，临床上很多患者和文献中报道，即使感染临床治愈后，部分患者会出现伤口周围特发性红肿和不明原因的湿疹，无论是否使用抗生素，这些症状都能得到缓解[15]。本文探索人工关节感染翻修术后近期关节和髓腔内细菌的残留情况，为上述争议和症状提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康成年新西兰大白兔64只（其中4只为备用组），雌雄不限，体重2.5～3.5 kg，平均2.8 kg（第二军医大学药学院动物实验中心提供），清洁级，适应性喂养1周，自由进食、饮水。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制作与实验设计：使用膝前外侧入路，暴露兔膝关节前髁，注意保护髌腱及前髁韧带，于负重面适当位置开槽，避免损伤交叉韧带和后外侧神经血管，用定制锉刀修整截骨面，植入定制型生物假体（图1），检查假体牢固度，确定假体位置及牢固度较好后冲洗关闭伤口。术后第2 d注入SE SAL65164金葡菌（第二军医大学微生物教研室提供）1×106CFU，1周后进行关节腔穿刺细菌培养，1只动物死亡，1只穿刺培养未得到细菌，备用组2只替代，30只感染模型构建成功[16]。实验组30只翻修术后第1～4周分别行关节灌洗液沉渣细菌培养和关节灌洗液沉渣遗传物质聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）检测，细菌培养结果为培养组，PCR检测结果为PCR组，将各时间点的培养组阳性率和PCR组检出率进行组间比较，同时将不同时间点的培养组阳性率和PCR组检出率进行时序性比较。此外，设立30只为阴性对照组，旨在说明未行关节翻修的关节腔内细菌可以持续检出，阴性对照组不用于统计分析。

1.2.2 翻修手术：采用二期翻修手术，关节置换原切口入路，切开外侧肌群后暴露兔膝关节，避免损伤髌韧带、前髁韧带、侧副韧带和交叉韧带；彻底清除关节腔内异常组织，取出原假体，双氧水、洗必泰、生理盐水反复冲洗浸泡后，更换手套及手术器械，实验组使用中空多孔关节假体＋植入式输液港系统（巴德公司提供）作为间置器填充，关节假体为定制的生物型假体，出现严重骨缺损的个体采用大直径假体，不使用骨水泥填充（图2）；阴性对照组未行手术干预。实验组动物二期翻修中1例出现假体周围骨折，备用组代替[11,14]。

1.2.3 围手术期处理：每天观察实验组动物体温、进食和伤口情况，观察远端肢体运动情况。实验组术后1周内通过输液港行关节内腔头孢唑啉1 g溶于500 ml生理盐水灌洗25 min，后用生理盐水2500 ml冲洗，全身使用头孢唑啉0.1 gTid（肌内注射），1周后停用抗生素。阴性对照组仅全身使用抗生素0.1gTid（肌肉注射）。

1.2.4 观察指标：术后第1～4周通过输液港行关节腔内2500 ml生理盐水灌洗，全部灌洗液离心（6000×g，10 min），取沉渣，两等分，分别用于细菌培养[17]和PCR检测23S rRNA基因、nuc基因[18,19]。细菌培养条件为5%去纤维羊血培养基，37℃恒温增菌培养箱培养48 h，阴性结果继续培养1周，阳性结果行过氧化氢实验和凝固酶实验，并抽提DNA鉴定菌株类型。

1.2.5 DNA抽提和PCR方法：使用QIAamp DNA套装（Qiagen，德国）提取DNA。PCR反应体系每30 μl包含1 μl nuc引物或23S rRNA引物10 pmol（Invitrogen，美国），5 μl DNA 模版，14 μl PCR 液（DNA聚合酶MgCl2,dNTPs）（Roche，德国），9 μl蒸馏水，自动扩增仪Mastercycler（Eppendorf，德国）完成扩增（表1）。二期翻修术后第4周，随机处死实验组15只，分别取假体周围、髓腔中段、髓腔远端组织，冰冻切片后革兰氏染色找金葡菌（图3），并取部分组织块增菌培养，并行过氧化氢实验和凝固酶实验[17,20]。

1.3 统计学处理

数据对实验者和统计员双盲。应用SPSS13.0统计软件，使用配对样本Pearson卡方分析比较各时间点培养组阳性率和PCR组检出率的组间差异，P＜0.05为有统计学差异；使用Pearson卡方分析两两比

较不同时间点的培养组阳性率和PCR组检出率的时序性差异，P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 实验组及对照组大体观察

实验组术后体温均正常、伤口愈合好，术后第3周缝线开始陆续脱落，远端肢体运动好，进食量未见明显减少；对照组术后7只体温升高，进食量减少，伤口红肿、渗出、愈合差，术后3～4周，其中4只窦道形成，每天换药可见淡黄色脓性渗出物5～20 ml，细菌学检验为凝固酶阳性、过氧化氢酶阳性、革兰氏阳性球菌，DNA鉴定为SE SAL65164金葡菌株，其中1只同时检出革兰氏阴性杆菌。

2.2 实验组细菌培养结果和PPCCRR检测结果

术后第1周灌洗液呈棕红色、悬浊液，离心后得到灰红色沉淀3.6 g，第2周灌洗液呈淡红色、悬浊液，离心后得到灰白色沉淀3.2 g，第3周灌洗液为无色透明悬液，离心后得到灰白色沉淀3.5 g，第4周灌洗液为无色透明悬液，沉淀后得到黄白色沉淀3.0 g。细菌培养结果示：术后第1～4周培养组阳性率分别为10%、3.33%、3.33%、3.33%7只标本有细菌生长，余未见细菌生长，细菌学检验示凝固酶阳性葡萄球菌，DNA鉴定为SE SAL65164金葡菌株；第2～4周，其中1只可见细菌生长，余未见细菌生长。术后第4周处死的实验组15只冰冻切片革兰氏染色，该只股骨后侧肌肉组织内发现革兰氏阳性球菌存在，同部位组织块血培养基培养，见凝固酶阳性、过氧化氢酶阳性球菌生长，DNA鉴定为SE SAL65164金葡菌株。PCR检测特定23S rRNA基因和nuc基因的组内分布结果示：术后第1～4周两种基因的组内分布无统计学差异，其检出率分别为83.33%、40.00%、30.00%、26.67%（表2、3）。

2.3 各时间点的组间差异和各组的时序性差异

实验组二期翻修术后各时间点的培养组结果和PCR组结果均有统计学差异（表4），认为术后第1～4周灌洗液沉淀物的细菌培养阳性率和PCR检出率不一致，且细菌培养结果均低于PCR检测结果。各组的时序性比较发现，实验组二期翻修术后第1～4周的PCR组结果持续下降，第1周的PCR检出率与第2～4周比较有统计学差异（P=0.001,0.000,0.000），而第2～4周之间无显著性差异（图4）。术后细菌培养结果时序分析显示，术后第1～4周的细菌培养阳性率比较无统计学差异（P=0.605）。第1周的细菌培养阳性率和PCR检出率与阴性对照组均无统计学差异，认为实验组干预有效，细菌培养阳性率与PCR检率率的差别并非由假阳性误差偏倚引起。

表2 实验组翻修术后第1～4周23S rRNA和nuc基因的PCR检测结果

表3 对照组翻修术后第4周23S rRNA和nuc基因的PCR检测结果

表4 实验组翻修术后各时间点的细菌培养组阳性率和PPCCRR组检出率比较（%%）

3 讨论

目前关节周围感染的治疗方式包括清创保留假体抗生素治疗、一期清创+翻修术、二期翻修术。早期的大样本关节置换感染认为：抗生素骨水泥假体二期翻修，平均随访4.8年，手术成功率超过80%，近期研究认为生物型假体一期翻修，随访3～4年，可以得到相似的结果，Soriano等[2]认为急性感染2周内，细菌菌膜未形成前行关节清创术，保留假体治疗后，感染再发率达30%；本实验在输液港帮助下，全身、局部使用抗生素，合并局部灌洗治疗1周后，灌洗液细菌培养阳性率为10%，金葡菌遗传物质检出率为83.33%，作者认为急性感染单纯清创治疗的有效率值得商榷。二期翻修放置spacer填充虽增加了手术次数，但细菌清除率得到保证，实验中的中空假体+输液港装置可实现术后实时灌洗和关节液培养，同时减少置管的逆向感染等问题，减少患者创伤。

传统观点无论一期手术还是二期翻修的前提是彻底清除细菌，关节周围感染主要是革兰阳性球菌，其中以金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌为主。文献报道，即使在严格伤口护理及每天换药的情况下，不同时间培养得到的细菌亦可能不一致，本实验对照组中1只出现类似情况。该现象出现的原因未见文献报道。文献证实，随着生存环境的变化细菌会改变以适应环境；关节腔内结构复杂，滑膜组织和肌肉间隙非常多，当处于休眠状态的细菌被包裹在这些软组织间隙时，是否会引起机体的炎症反映，是否具有趋化作用和免疫源性，目前尚未得到研究。清创后4周内，虽然细菌培养未见细菌生长，但细菌遗传物质不断被检出，且两者间有统计学差异，抗生素的抑制作用、细菌生物活性改变、死亡细菌的遗传物质残留都会导致这种差异，有待进一步验证细菌活性、毒性和基因分型等。

关节液内无血液，无法形成有效抗菌环境，当内环境适宜时残留的细菌和死亡细菌的遗传物质会再次成为危险因素。新的细菌定植时，致病因子的基因通过转座作用整合在新细菌体内，如一些细菌形成菌膜的能力和一些细菌耐药性的获得是通过鞭毛交换遗传物质实现的，因此局部大量检出金葡菌遗传物质亦为危险因素[21-23]。即使是遗传物质本身，再次入血也会导致超敏反应发生。

时序检测证实细菌的遗传物质检出率随时间延长而急剧下降，且细菌培养的阳性率也有所下降，作 者推测与输液港的冲洗作用和组织的代谢密切相关，增加手术间隔对提高翻修手术的成功率非常有意义。本实验中1只持续细菌培养阳性可能与清创不彻底、间隙内细菌残留并持续释放有关，临床指标持续不下降应考虑穿刺或灌洗培养，只要细菌培养阳性应尽快二次清创，并彻底寻找隐藏细菌[24]。

综上所述，关节翻修术后细菌在关节腔内的分布非常复杂，一期清创手术的选择应非常慎重；遗传物质的残存作为潜在危险因素可带来临床症状，遗传物质残存在感染复发和细菌变异中的作用值得深入研究。

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