酶解玉米黄粉制备降血压肽的研究

王俊彤 郑喜群 刘晓兰

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

高血压是一种以动脉收缩或舒张压升高为特征的临床综合症，它会对大脑、心血管及肾脏造成损害［1］。血管紧张素转化酶（angiotensin I－converting enzyme，ACE）是影响人体血压平衡的重要因素［2］。目前，治疗高血压的药物多为化学合成的ACE抑制剂（ACEI）。这些药物虽然效果显著，但长期服用会对人体产生各种不良反应，且停药后血压易反弹。与此相比，以动植物为来源的降血压肽不仅具有良好的降血压效果，而且无毒副作用，适合各种人群服用［3］。

玉米黄粉（corn gluten meal，又称玉米蛋白粉）是玉米湿法加工淀粉过程中的主要副产物之一，含有62%～71%的蛋白质［4］。由于玉米黄粉成分复杂，口感粗糙，水溶性低，功能特性差，难以直接利用［5］。但玉米蛋白的氨基酸组成独特，含有高比例的亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸和脯氨酸等疏水性氨基酸，很少含有赖氨酸等碱性氨基酸，这使它成为制备多种生理活性肽，特别是降血压多肽的良好来源［6］。风味蛋白酶包含内切蛋白酶和外切蛋白酶两种活性，适用于生产低苦味多肽，能够较好的改善水解物的风味［7］。另外，它是由微生物发酵而得，价格便宜，适合工业生产。因此，利用风味蛋白酶水解玉米黄粉，可以获得ACE抑制率较高及风味较佳的玉米肽产品。本研究以玉米黄粉为原料，对风味蛋白酶水解制备降血压肽的工艺进行初探，旨在为ACE抑制肽的分离纯化及工业化生产提供理论依据和工艺参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

玉米黄粉：蛋白质含量56.24%，黑龙江龙凤玉米开发有限公司；

α－淀粉酶：酶活为2.85×103U／g，北京双旋微生物培养基制品厂；

Flavourzyme风味蛋白酶：酶活为3.37×104U／g，丹麦NovoNordisk公司；

ACE、Hip－His－Leu（HHL）：美国Sigma公司；

其他试剂：均为分析纯，市售。

1.1.2 主要仪器设备

台式离心机：TCL－16G型，上海安亭科学仪器厂；

电热恒温鼓风干燥箱：101－3－S型，上海跃进医疗器械厂；

水浴恒温振荡器：SHZ－88型，上海跃进医疗器械厂；

pH计：pB－10型，赛多利斯科学仪器有限公司；

Beckman分光光度计：DU800型，美国Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米黄粉的预处理方法 采用挤压膨化和去淀粉处理［8］。将玉米黄粉用双螺杆膨化机膨化。调节玉米黄粉含水量至16%，膨化机在160～180℃，1.0～1.5MPa条件下进行膨化。膨化后在室温下干燥，粉碎、过60目筛。再用pH 6.0的0.02mol／L磷酸盐缓冲将挤压膨化后的玉米黄粉配制成浓度为10%（m／V）的悬浮液。加入α－淀粉酶（30U／g），60℃水解2h。反应结束后酶解液在100℃灭酶30min。水解后沉淀用等量的水洗涤3次，彻底去除淀粉水解的产物。最后将去掉淀粉的玉米黄粉在60～70℃的烘箱中烘干，粉碎，作为蛋白酶酶解试验的原料。

1.2.2 风味蛋白酶Flavourzyme水解玉米黄粉的条件优化

用磷酸盐缓冲液将预处理的玉米黄粉配制成一定浓度的悬浮液，进行Flavourzyme催化水解反应，每隔一定时间取适量水解液，立即于沸水中加热20min以钝化酶活力，4 000r／min离心20min，测定上清液中ACE抑制率。以水解温度、水解液pH、底物浓度和加酶量为因素进行单因素和正交试验，确定风味蛋白酶水解玉米黄粉的最佳条件。

单因素试验方法：① 温度对玉米黄粉水解物ACE抑制率 的 影 响：在 底 物 浓 度 为 5%（m／V）， 加 酶 量 为3% （m／m），水解液pH 6.0条件下，考察温度分别为45，50，55℃时对Flavourzyme催化水解反应的影响；② 水解液pH对玉米黄粉水解物ACE抑制率的影响：在底物浓度为5% （m／V），加酶量为3% （m／m），温度为50℃条件下，考察水解pH分别为6.0、6.5和7.0时对Flavourzyme催化水解反应的影响；③ 底物浓度对玉米黄粉水解物ACE抑制率的影响：在加酶量为3% （m／m），水解液pH 6.0，温度为50℃条件下，考察底物浓度分别为4%、5%和6%（m／V）时对Flavourzyme催化水解反应的影响；④ 加酶量对玉米黄粉水解物ACE抑制率的影响：在温度为50℃，底物浓度为5%（m／V），水解液pH 6.0条件下，考察加酶量分别为2%、3%和4%（m／m）时对Flavourzyme催化水解反应的影响。

1.2.3 ACE抑制率的测定 参照 Cushman［9］紫外分光光度法的基本原理测定。

1.2.4 不同分子量水解产物的制备 选用截留分子量为10kDa和6kDa的中空纤维素膜对玉米黄水解液进行超滤处理，将水解液分为＞10kDa，6～10kDa，＜6kDa 3个组分。超滤压力0.1MPa，温度为室温。

2 结果与讨论

2.1 温度对玉米黄粉水解物ACE抑制率的影响

由图1可知，随着温度升高，水解物ACE抑制率增加，但温度过高时，水解物ACE抑制率反而降低，可能是由于Flavourzyme不耐高温，高于50℃时会使其分子的次级键断裂，使蛋白酶变性，酶分子的活性减弱甚至完全失活，导致水解物中ACE抑制肽产率降低。温度为50℃时，水解物ACE抑制率最高，其次是45℃。因此选择酶解温度为50℃。

图1 温度对玉米黄粉水解物ACE抑制率的影响Figure 1 Effect of temperature on ACE inhibitory activity of hydrolysate from CGM

2.2 pH对玉米黄粉水解物ACE抑制率的影响

由图2可知，Flavourzyme为酸性蛋白酶，在较低的pH范围内，具有较强的酶解能力。水解反应初期，不同pH条件下水解物ACE抑制率相当，随着水解时间的延长pH 6.0的水解物ACE抑制率变化较为平稳，而其它水解反应进行6h时，ACE抑制率都有明显降低，随后又逐渐增大。其中pH 6.5、水解8h时，水解物 ACE抑制率最高，达67.46%±3.45%，因此，选择pH 6.5为最适pH。由于水解过程复杂，水解反应进行中，不断有肽键发生断裂和缩合，导致水解产物的ACE抑制率呈现波浪式变化。

图2 pH对玉米蛋白粉水解物ACE抑制率的影响Figure 2 Effect of pH on ACE inhibitory activity of hydrolysate from CGM

2.3 底物浓度对玉米黄粉水解物ACE抑制率的影响

由图3可知，随着底物浓度的增加，水解物ACE抑制率呈先增大后减小的变化趋势，适当增加底物浓度使蛋白酶作用位点增多，酶与底物充分结合，ACE抑制肽含量增加。但底物浓度过高，会对酶产生竞争性抑制，水解反应变弱。当底物浓度为5%时，水解物ACE抑制率最高，继续增加底物浓度并没提高ACE抑制率。因此，选择底物浓度为5%。

图3 底物浓度对玉米黄粉水解物ACE抑制率的影响Figure 3 Effect of substrate concentration on ACE inhibitory activity of hydrolysate from CGM

2.4 加酶量对玉米黄粉水解物ACE抑制率的影响

由图4可知，当加酶量较低时，有足够的底物与酶结合，水解物ACE抑制率与加酶量成正比；当加酶量较高时，玉米黄粉的相对浓度较小，产物积累对酶产生竞争性抑制，水解物ACE抑制率降低。当加酶量为4%时，其水解物ACE抑制率与加酶量为3%时相比，并没有显著提高，且水解8h时，两者水解物ACE抑制率相当。综合考虑选择加酶量为3%。

图4 加酶量对水解物ACE抑制率的影响Figure 4 Effect of E∶S on ACE inhibitory activity of hydrolysate from CGM

2.5 正交试验

在单因素试验基础上，进一步探讨最佳水解条件，以ACE抑制率为指标判定Flavourzyme对玉米黄粉的酶解效果，选择水解温度、水解液pH、加酶量和底物浓度4个因素，设计L9（34）正交试验。根据单因素试验可知，酶解时间为8h的水解物ACE抑制率最大，所以确定正交试验水解时间定为8h。试验方案及方差分析见表1～3。

由表2可知，Flavourzyme水解玉米黄粉制备ACE抑制肽时，影响水解物ACE抑制率的因素主次顺序为加酶量（D）＞底物浓度（C）＞pH（A）＞温度（B）。最佳组合为A2B1C2D2，即加酶量为3.5% （m／m），底物浓度为6.0%（m／V），水解温度为45℃，pH为6.75。由表3可知，仅加酶量对水解物ACE抑制率影响显著。经验证实验，水解物ACE抑制率为68.16%，可溶性蛋白含量为2.59mg／mL。刘萍等［10］用风味蛋白酶酶解玉米蛋白时，其水解产物ACE抑制率为31.86%。刘志国等［11］分别用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶对玉米醇溶蛋白进行水解，其水解产物ACE抑制率分别为33.13%、68.36%和45.55%。本研究中得到的水解物ACE抑制率较高。

表1 L9（34）正交试验表Table 1 Factors and levels of orthogonal test L9（34）

表2 L9（34）正交试验结果与分析†Table 2 Result and analysis of orthogonal test（n ＝3）

2.6 不同分子量水解产物的ACE抑制率

玉米黄粉水解液首先通过一个截留分子量为10kDa的超滤膜。水解液的一部分立刻被分开，再将滤液通过一个截留分子量为6kDa的超滤膜，即得到＞10kDa，6～10kDa和＜6kDa 3个分子量范围的多肽组分，各组分分别冷冻抽干，再配制成一定浓度的蛋白溶液（2.6mg／mL）。各组分蛋白溶液的ACE抑制率见表4。由表4可知，＜6kDa组分的ACE抑制率最高，比原水解液增加约20%，且含量占总水解产物的40%左右。此现象说明风味蛋白酶酶解玉米黄粉的水解物中的ACE抑制肽多为小分子量短肽，这与相关报道［1］相符。对水解液进行分级分离，获得ACE抑制率较高的多肽组分，这为进一步分离纯化奠定了基础。

表3 方差分析结果†Table 3 Result of variance analysis

表4 各组分蛋白溶液的ACE抑制率Table 4 ACE inhibitory activity of each fraction／%

3 结论

以玉米黄粉为原料，经挤压膨化和去淀粉处理后，利用Flavourzyme酶解制备ACE抑制肽，确定最优工艺条件为温度45 ℃，pH 6.75，底 物 浓 度 6.0% （m／V），加 酶 量3.5%（m／m），水解时间8h。在此条件下ACE抑制率为68.16%。水解物经超滤，被分为＞10kDa，6～10kDa和＜6kDa 3个组分，其中低分子量组分的ACE抑制率明显高于超滤前的玉米黄粉水解液，为88.73%。

本研究发现Flavourzyme水解产物虽然ACE抑制率较高，但水解液中可溶性蛋白含量较低。因此，需要进一步研究以提高蛋白回收率，并开发具有较高ACE抑制活性的低苦味玉米肽产品。随着人们自我保健意识和安全意识的增强，这类药食两用的天然降血压活性肽产品越来越受到人们的青睐，具有广阔的发展前景。

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5 郭玲玲.国内外玉米加工现状及发展趋势［J］.农业科技与装备，2010（9）：8～10.

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8 郑喜群.玉米黄粉的酶解工艺与抗氧化活性肽的制备［D］.北京：中国农业大学，2006.

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10 刘萍，陈黎斌，杨严俊.酶解玉米蛋白制备降血压肽的研究［J］.食品工业科，2006，27（5）：117～122.

11 刘志国，陈江源，王亚林.玉米醇溶蛋白酶解制备ACE抑制肽［J］.食品研究与开发，2006，27（2）：138～141.