黄瓜香水提物对自由基损伤心肌细胞的作用＊

何 轩，彭光勇，黄露露，王云召，刘 锦，彭湘萍，李春艳

（吉首大学医学院，湖南吉首 416000）

黄瓜香水提物对自由基损伤心肌细胞的作用＊

何 轩，彭光勇，黄露露，王云召，刘 锦，彭湘萍，李春艳

（吉首大学医学院，湖南吉首 416000）

目的 观察黄瓜香水提物对自由基损伤的心肌细胞的作用.方法 体外培养心肌细胞，以不同浓度的黄瓜香水提物进行干预，测定心肌细胞搏动频率及培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的活性，采用MTT法观察黄瓜香水提物对心肌细胞存活率的影响.结果自由基对心肌细胞造成损伤，不同浓度的黄瓜香水提物可减少LDH漏出，增加细胞存活率（P＜0.05）.结论 黄瓜香对自由基损伤的心肌细胞具有保护作用.

黄瓜香水提物；心肌细胞；自由基

湘西民间草药黄瓜香主要的化学成分是黄酮，黄酮对扩张冠状动脉、增加血管灌流量和心肌营养性血流、增加心肌收缩力、抗心律失常和调脂降压等均有明显的效应［1］.研究开发安全有效的天然药物已成为医药界的探索热点，文献［2］研究已显示黄瓜香水提物具有保护大鼠急性心肌缺血作用.本文采用心肌细胞体外培养方法，观察黄瓜香水提物对自由基损伤心肌细胞的保护作用，为黄瓜香的进一步开发利用提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

新生SD大鼠（雌雄不拒），由中南大学医学院实验动物部提供，新生牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶、DMEM（Gibco公司），乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒（南京建成生物有限公司），其他试剂均为国产分析纯.723分光光度计（上海光谱仪器有限公司），酶标仪（瑞士Tecan公司），倒置显微镜（日本Nikon），低温高速离心机（上海仪器仪表有限公司），细胞培养箱（IT61，日本），超净工作台（中国苏州设备公司）.

1.2 黄瓜香水提物

黄瓜香的全草水提取物由吉首大学药理学实验室提供，采用传统方法水提、浓缩，临用时稀释成所需（实验室所用剂量均与生药计）3种质量浓度（2g／mL，1g／mL，0.5g／mL），过滤除菌备用.

1.3 乳鼠心肌细胞培养

取24h内新生乳鼠，在无菌状态下取出心脏组织剪碎，加入质量分数为0.125%胰酶反复消化.将收集的细胞制备成心肌细胞悬液接种培养皿，用质量分数为10%DMEM培养液置于37℃、质量分数为5% CO2孵箱进行原代培养，培养每48h换1次培养液.

1.4 实验分组

实验分为3组.正常对照组：加入等体积生理盐水.损伤组：加入黄嘌呤100μL和黄嘌呤氧化酶1 50μL，调整培养液中最终浓度为5.0mol／L和5×10－5mol／L［3］.药物处理组：每孔加入250μL不同浓度黄瓜香水提物后，按损伤组依次加入黄嘌呤100μL和黄嘌呤氧化酶150μL.

1.5 观察指标及方法

各实验组用倒置显微镜观察并计数心肌细胞搏动的频率.取培养上清液按照试剂盒说明测定LDH活性.MTT比色法测定细胞存活率，每孔加5mg／mL MTT 20μL，再培养4h后，加DMSO 150μL／孔，室温振荡10min，待试剂完全溶解后，用酶标仪在波长490nm处读取吸光度（OD）.取6孔OD值的均数按公式计算细胞存活率，细胞存活率＝处理组细胞OD均值／对照组细胞OD均值×100%.

2 结果

2.1 黄瓜香水提物对心肌细胞搏动的影响

正常组心肌细胞搏动正常，节律规则，搏动有力.损伤组心肌细胞搏动频率减慢，搏动幅度减弱，有部分脱落.与损伤组相比，黄瓜香水提物处理组心肌细胞搏动增加（P＜0.05），但节律失常多见，搏动减弱.各处理组对心肌细胞搏动的影响如表1所示.

表1 各处理组对心肌细胞搏动的影响（±s，n＝6）

表1 各处理组对心肌细胞搏动的影响（±s，n＝6）

注 与正常组相比较，a表示P＜0.05；与模型组比较，b表示P＜0.05

组别 剂量／（g·mL－1） 频率正常组95±24损伤组 24±8a VDG高剂量 2.0 52±14b VDG中剂量 1.0 56±23b VDG低剂量 0.5 57±16b

2.2 黄瓜香水提物对自由基损伤后心肌细胞存活率的影响

MTT法各处理组对心肌细胞存活率的影响如表2所示，在自由基损伤前，分别给予不同浓度的黄瓜香水提物预处理，心肌细胞存活率分别为57.96%，61.06%，59.29%，与损伤对照组比较有显著性差异（P＜0.05），其中以1g／mL浓度效果最好.表明自由基损伤心肌细胞，降低其存活率，而黄瓜香水提物可对抗其损伤作用.

表2 MTT法各处理组对心肌细胞存活率的影响±s，n＝6）

表2 MTT法各处理组对心肌细胞存活率的影响±s，n＝6）

注 与正常组相比较，a表示P＜0.05；与模型组比较，b表示P＜0.05

组别 剂量／（g·mL－1） OD值 存活率／%正常组0.452±0.03 100损伤组 0.198±0.08a 43.80a VDG高剂量 2.0 0.262±0.04b 57.96b VDG中剂量 1.0 0.276±0.13b 61.06b VDG低剂量 0.5 0.268±0.06b 59.29b

2.3 黄瓜香水提物对自由基损伤后LDH的影响

各处理组对心肌细胞LDH活性如表3所示.由表3可见，与正常组相比，自由基组LDH增加（P＜0.05），与损伤组相比，不同浓度的黄瓜香水提物处理组LDH活性降低，其中质量浓度为1g／mL效果最好.

表3 各处理组对心肌细胞LDH活性±s，n＝6）

表3 各处理组对心肌细胞LDH活性±s，n＝6）

注 与正常组相比较，a表示P＜0.05；与模型组比较，b表示P＜0.05

组别 剂量／（g·mL－1）LDH／（U·L－1）正常组4.42±0.43损伤组 43.56±4.28a VDG高剂量 2.0 31.13±2.34b VDG中剂量 1.0 24.26±2.13b VDG低剂量 0.5 26.16±4.26b

3 讨论

（1）心血管疾病是危害人类健康和生命的严重疾病，其发病率呈不断上升的趋势，严重地影响着人们的生活质量及生命安全，尤其是缺血性心脏病.LDH作为机体能量代谢中重要的一种酶，其质和量的改变直接影响机体的能量代谢，心肌缺血后，心肌细胞膜受损，LDH作为细胞浆中的酶可大量溢出，因此血清中LDH水平可作为判断心肌细胞膜损伤的间接指标.黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤生成超氧阴离子和过氧化氢，可对细胞造成损伤.

（2）黄瓜香药源充足，来源丰富，取材方便，有着悠久民间使用历史，具有极好的开发利用前景.

（3）黄瓜香水提物预处理可以明显提高自由基损伤后心肌细胞的存活率，减少LDH漏出，从而表明黄瓜香水提物具有保护心肌细胞的作用，使细胞损伤减轻，增加活力，其机制可能与抗氧化、清除自由基有关.

［1］ 路培培，刘俊田，刘 娜，等.鹿衔草总黄酮对大鼠急性心肌缺血的影响［J］.西安交通大学学报：医学版，2010，31（5）：581－83.

［2］ 彭湘萍，彭振宇，彭英福，等.黄瓜香提取物对大鼠急性心肌缺血的实验研究［J］.中国民族民间医药，2011，20（171）：36－37.

［3］ 王达理，曾爱萍，南柏松.红花水提物抗自由基保护心肌细胞的作用［J］.中国中医基础医学杂志，2001，7（2）：34－35.

（责任编辑 陈炳权）

Experimental Study on the Influence of Viola Diffusa Ging Extract on Myocardial Cells

HE Xuan，PENG Guan－yong，HUANG Lu－lu，WANG Yun－zhao，LIU Jin，PENG Xiang－ping，LI Chun－yan
（Medical College of Jishou University，Jishou 416000，Hunan China）

Objective：to study the influence of viola diffusa gine（VDG）extract on myocardial cells.Methods：myocardial cells were cultured with different concentrations of VDG extract to intervene.The myocardial cells pulse frequency and the contents of lactate dehydrgenase（LDH）in culture solution were determined.MTT method was used to observe the cells survival rate.Results：free radicals injured myocardial cell，VDG extract reduced LDH leakage and increased the cell survival rate（P＜0.05）.Conclusion：The results indicate that VDG extract has a certain protective effects on myocardial cells injured by free radicals.

Viola diffusa Ging（VDG）；myocardial cells；free radicals

R285.5

A

10.3969／j.issn.1007－2985.2013.03.014

1007－2985（2013）03－0066－03

2013－04－25

湖南省大学生创新性学习和创新性实验计划资助项目（湘教通（2011）272号）；吉首大学大学生研究性学习和创新性实验资助项目（JSU－CX－2011－36）

何 轩（1988－），男（白族），湖南吉首人，吉首大学医学院临床医学学生

李春艳（1965－），女（土家族），湖南龙山人，吉首大学医学院教授，主要从事高等医学教育和湘西民族药物研究.E－mail：lchy1965＠163.com.