RNA干扰茄病镰刀菌ALP基因及其基因沉默菌株的制备

梁涛 刘珂凤 何宏 赵桂秋 王婷 喻文倩

(1.青岛大学医学院附属医院眼科，青岛 266003;2.青岛大学医学院附属医院检验科，青岛 266003)

真菌性角膜炎是一种世界范围的角膜感染性疾病，致盲率极高，治疗一直较为棘手。在目前临床上常用的眼部抗真菌药物在不同程度上具有抗菌谱窄、穿透力差、毒副作用较大等缺点，治疗效果并不十分理想。因此，确定真菌的毒力因子、发现新的药物作用靶点已经成为抗真菌基础研究和研制新型抗真菌药物的首要环节。以往此类研究常用的方法是基因敲除，然而由于茄病镰刀菌等丝状真菌中同源重组的效率极低，基因敲除的效果并不理想［1］。RNA干扰是一种通过双链小分子RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默现象，利用RNA干扰诱导的RNA沉默已经成功用于癌症、病毒感染的治疗，其效果远优于传统的基因或抗体的阻断性治疗。我们通过制备RNA干扰载体质粒，转化茄病镰刀菌孢子并对ALP沉默菌株ALP转录水平及酶活性进行检测，以期获取ALP基因沉默菌株，为将来进行动物体内实验研究真菌侵袭机制提供有利条件。

1 材料与方法

1.1 菌株及主要培养基

标准茄病镰孢菌株 (Fusarium solani)由中国医学科学院皮肤病医院真菌中心提供，编号:CMCC(F)B24c;JM109为本实验室保存;真菌沙氏(Sabouraud)培养基、2%麦芽糖肉汤液体培养基、YED、LB液体培养基购自青岛海博生物技术有限公司;蛋白琼脂廓清率特殊培养基 (包括琼脂1.5 g、葡萄糖 2.7 g、氯霉素 0.01 g、无菌去离子水 100 mL 加入甘氨酸 13 mmol/L、KH2PO429.4 mmol/L、MgSO410 mmol/L、维生素 B13 μmol/L、pH4.5 偶氮白蛋白 0.1 g。)

1.2 方法

双链RNA干扰 (RNAi)的载体质粒的构建根据Pubmed Genebank中检索到的茄病镰刀菌ALP(序列号S71812)的保守区域RNA干扰部位，设计ALP功能域的长度分别为498 bp、531 bp两个序列作为干扰片段。设计带有酶切位点的两套引物，通过一系列PCR扩增和双酶切将其正反向序列插入载体质粒pBC-hygro(由法国Institut de Génétique et Microbiologie Philippe Silar教授惠赠)中，中间隔以250 bp的GFP序列形成发夹状结构，构建了载体质粒pALP1和pALP2(见表1～2)。

表1 扩增引物1Tab.1 Amplification primers 1

表2 扩增引物2Tab.2 Amplification primers 2

载体质粒pALP1和pALP2构建的PCR扩增体系 以提取的茄病镰刀菌和GFP基因作为模板，分别以引物X-1至X-6、X-7至X-12依次进行一系列PCR扩增，部分PCR反应体系如下。

Ⅰ用引物X-1和X-2，以茄病镰刀菌基因组为模板，进行PCR扩增，目的片段命名为X-A。PCR反应体系见表3。

表3 PCR反应体系Tab.3 PCR reaction system

反应条件为:第一步，94℃ 7 min;第二步，94℃1 min，58℃ 45 s，72℃ 50 s，共进行30 个循环;第三步，72℃ 10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳、割胶回收，备用。

Ⅱ用X-3和X-4为引物，以GFP基因为模板，进行PCR扩增，目的片段命名为X-B。PCR反应体系同上，反应条件为:第一步，94℃ 7 min;第二步，94℃ 1 min，57℃ 30 s，72℃ 45 s，共进行 30 个循环;第三步，72℃ 10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳、割胶回收，备用。

1.3 测序

将所构建质粒载体pALP1、pALP2送北京博迈德科技发展公司进行测序。

1.4 构建的载体质粒转化茄病镰刀菌及抗性筛选

分别将携带有pALP1、pALP2的JM109大肠杆菌接种至含有氯霉素的LB液体培养基中培养。提取单克隆阳性质粒，备转化茄病镰刀菌孢子用。将生长于Sabouraud培养基中的茄病镰刀菌1.0×107spores/mL接种于YED液体培养基中。采用醋酸锂转化法对茄病镰刀菌孢子进行转化，参 照 Mukherjee 方 法 略 加 改 进［2］，配 制PEG4000-LiAc培养液。将分生孢子悬液与pALP1和pALP2混匀后经过一系列处理后加600 μL 0.1M(pH6.0)的醋酸锂;涂布于含有潮霉素B(终浓度为200 μg/mL)选择性培养基平板上28℃培养。挑取单个阳性菌落涂布于潮霉素B(终浓度为200 μg/mL)抗性的 Sabouraud培养基，37℃培养，36 h后观察结果。所获菌株命名为 ΔALP1、ΔALP2。

1.5茄病镰刀菌ALP基因沉默后转录水平的检测

提取镰刀菌总RNA［3］，RT-PCR检测茄病镰刀菌ALP mRNA转录水平的变化，设计合成引物见表4。

表4 设计合成引物Tab.4 The designed primers

进行一步法 RT-PCR，反应条件为:42℃，50 min;95℃，5 min;94℃，30 s;58℃，45 s;72℃，45 s;32个循环;72℃，7 min，重复3次。以茄病镰刀菌18s rRNA为内参照，扩增产物经扩增产物经1.0%琼脂糖电泳后于UNIUER SAL HooD-S.N.75s凝胶成像分析系统分析，分别对电泳条带进行灰度扫描，得到各条带的峰面积积分值，计算它们与18s rRNA比值获得校正值。

1.6 RNA干扰后茄病镰刀菌ALP酶活性检测

参照文献［4］制作含有0.1%偶氮白蛋白的蛋白琼脂廓清特殊培养基，按等边三角形选取3个点，各滴加 10 μL标准茄病镰刀菌、ΔALP1和ΔALP2孢子悬液，每菌株接种6个平皿，30℃培养12 d。含有偶氮白蛋白，培养基略呈橙黄色。茄病镰刀菌分泌的ALP可水解培养基底物中的偶氮白蛋白，菌落周围培养基中的偶氮白蛋白在被水解后逐渐形成透明的晕环(廓清环)，因此可以通过测量廓清环的大小检测茄病镰刀菌ALP的活性。CH值的计算参照Price法［5］:CH=菌落半径/(菌落半径+廓清环半径)。CH值越小，表明真菌蛋白酶分泌量越多、活性越强;CH值越大表明蛋白酶分泌量越小、活性越弱，真菌毒力越低。于接种后第12 d测量各菌株CH值，取均值进行统计学分析。

1.7 统计学分析

实验所得数据均用(±s)表示。采用SPSS 11.0统计分析软件对数据进行统计学处理，各组间差异用单因素方差分析 (one-way ANOVA)和q检验。取P＜0.05为差别有统计意义，P＜0.01为差别有显著统计意义。

2 结 果

2.1 RNA干扰载体质粒的构建

构建载体质粒pALP1和pALP2，提取阳性质粒并进行酶切鉴定，各插入序列测序结果与设计序列一致。

2.2 基因沉默茄病镰刀菌转录水平 ΔALP2、ΔALP2 mRNA的检测

以标准茄病镰刀菌为对照，RT-PCR对ΔALP1、ΔALP2菌株ALP mRNA转录水平进行检测。半定量分析显示，ΔALP1菌株ALP mRNA转录水平为标准菌株的 42.77%(1.248/2.918)，ΔALP2菌株ALP mRNA转录水平仅为标准菌株的69.57%(2.030/2.918)，两者较标准菌株差异均具有显著统计学意义 (F=184.67，q=10.379～26.943，P＜0.01)，结果详见表5。

表5ΔALP1、ΔALP2 mRNA转录水平的变化(x珋±s)Tab.5 The changes of ΔALP1 and ΔALP2 gene transcription(珋x ± s)

2.3 RNA干扰后茄病镰刀菌ALP酶活性检测结果

接种于含有偶氮白蛋白的特殊培养基上的标准茄病镰孢菌、ΔALP1和ΔALP2菌株30℃培养12 d后，菌落周围出现明显的透明廓清环，各株菌落直径大致相同，ΔALP2株的廓清环明显小于标准菌株与ΔALP1株，其CH值与后两者比较，差异具有显著统计学意义 (q=5.276、5.463，P＜0.01)，结果详见表6。

表6ΔALP1、ΔALP2菌株ALP酶活性的变化(x珋±s)Tab.6Changes of△ALP1 and△ALP2 enzymatic activities(x珋±s)

3 讨 论

真菌性角膜炎病情严重，镰刀菌和曲霉菌是我国主要的眼部致病真菌，其中大部分地区以镰刀菌为主。研究显示该菌引起的角膜炎预后更差，易导致严重的视力损害［6-7］。因此，对镰刀菌性角膜炎发病机制进行深入研究具有很重要的意义。RNA干扰是指在进化过程中高度保守、由双链RNA(dsRNA)诱发的、同源mRNA高度特异性降解的现象。通过该技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，目前被广泛用于探索基因功能和疾病的基因治疗领域。近年来，随着大量丝状真菌基因序列信息的测定，国内外相关研究已陆续展开。

对真菌侵袭力的相关研究表明，真菌分泌的酶类在其感染宿主的过程中扮演着重要角色。ALP是从烟曲霉菌培养液中分离出的一种碱性蛋白酶，可以劈开基质金属蛋白酶(MMPs)前肽链、使其活性中心暴露，从而使MMP-1、MMP-9等活化，目前被认为是致病性真菌潜在的毒力因子。对烟曲霉菌肺损伤的研究显示［8］，ALP能够快速降解人肺组织中I型、III型胶原和纤维连接蛋白，导致呼吸道明显破坏，并可在1 h内完全降解组织切片中的层黏连蛋白。另有研究显示［9］，茄病镰刀菌在富有胶原的培养基中能够产生丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。但是在它们感染的角膜炎动物模型的角膜组织中仅检测到金属蛋白酶，而且被证实为组织中激活炎性细胞(PMN)所释放的MMP-9，因而推测是致病真菌产生少量的丝氨酸蛋白酶，PMN和角膜细胞释放大量的MMP-9，进而导致角膜基质降解［10］，目前其他角膜致病真菌尚未见相关报道。

本实验针对茄病镰刀菌ALP基因构建RNA干扰载体质粒，采用醋酸锂转化法转化茄病镰刀菌孢子，结果显示，经RNA干扰载体质粒转化后，基因沉默株ΔALP1、ΔALP2ALPmRNA转录水平较标准菌株分别下降了42.77%和69.57%，显示基因沉默菌株mRNA转录水平明显下调。对RNA干扰后基因沉默菌株酶活性检测结果显示，各基因沉默株相应ALP对底物分解能力受到了不同程度的抑制，酶活性均有明显下降，这提示我们干扰后的茄病镰刀菌株的毒力有可能减弱。从酶活性检测结果看，ΔALP2株的廓清环明显小于标准菌株与ΔALP1株，其CH值与后两者比较，差异具有显著统计学意义 (q=5.276、5.463，P＜0.01)。综合mRNA和酶活性分析两者检测结果，ΔALP2菌株所取得的基因沉默效果更佳。ALP基因沉默茄病镰刀菌株的获取将有助于深入研究镰刀菌的基因功能，对与茄病镰刀菌侵袭性相关的基因进行有针对性的单一干预操作可为阐明真菌性角膜炎发病机制、寻找崭有效的治疗措施开辟新的途径。

［1］Mouyna I，Sarfati J，Recco P，et al.Molecular characterization of a cell wall-associated beta(1-3)endoglucanase ofAspergillus fumigatus［J］.Med Mycol，2002，40(5):455-464.

［2］Mukherjee PK，Seshan KR，Leidich SD，et al.Reintroduction of the PLB1 gene intoCandida albicansrestores virulence in vivo［J］.Microbiology，2001，147(Pt9):2585-2597.

［3］梁涛.RNA干扰曲霉菌ALP、PLB基因表达治疗真菌性角膜炎的实验研究［D］.青岛:青岛大学眼科学，2010.

［4］徐赤宇，温海，王溪涛，等.新型隐球菌的细胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶活性检测［J］.第二军医大学学报，2006，27(2):125-128.

［5］Price MF，Wilkinson ID，Gentry LO.Plate method foe detection of phospholipase activity inCandida albicans［J］.Sabouraudia，1982，20(1):7-14.

［6］王丽娅，张月琴，王印其，等.中国三地区真菌性角膜病致病菌种的调查［J］.中华眼科杂志，2000，36(2):8-12.

［7］贺燚，孙秉基，赵东卿，等.真菌性角膜炎的临床特征及疗效观察［J］.中华眼科杂志，2000，36(5):358-361.

［8］Iadarola P，Lungarella G，Martorana PA，et al.Lung injury and degradation of extracellular matrix components byAspergillus fumigatusserine proteinase［J］.Exp Lung Res，1998，24(3):233-251.

［9］Zhu WS，Wojdyla K，Donlon K，et al.Extracellular proteases ofAspergillus flavus.Fungal keratitis，proteases，and pathogenesis［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，1990，13(6):491-497.

［10］Gopinathan U，Ramakrishna T，Willcox M，et al.Enzymatic，clinical and histologic evaluation of corneal tissues in experimental fungal keratitis in rabbits［J］.Exp Eye Res，2001，72(4):433-442.