几种植物源活性物质对昆虫细胞的毒力测定

杨菁菁， 蒋红云， 张 兰， 沈斌斌

（1.华南农业大学资源与环境学院，昆虫生态研究室，广州 510642；2.中国农业科学院植物保护研究所，农业部作物有害生物综合治理综合性重点实验室，北京 100193）

生物测定作为一种手段，广泛应用于新农药的筛选、毒力测定与药效试验及抗药性检测等方面。毒力测定方法包括药膜法、浸渍法、喷雾法等，这些方法都是利用活体昆虫进行生物测定，随着农药创制的发展，传统的生物测定技术的缺点越来越明显。特别是在研究天然产物中的杀虫活性物质时，由于其含量较低，又有协同、拮抗效应，致使工作量加大，成本较高，周期长，已不能满足批量新化合物活性筛选的需要，因此，需要一些新的筛选方法来适应新农药创制的迅速发展［1］。基于细胞水平的试验，以微孔板为试验工具，通过灵敏准确的检测仪器收集数据，具有快速、准确、灵敏等优点，为化合物的大规模生物活性测定提供了一种有效的方法［2－3］。

利用离体昆虫细胞代替活体进行活性测定是一种直接反映化合物毒性作用的检测方法。本试验研究了几种植物源活性物质对甜菜夜蛾［Spodoptera exigua（Hübner）］IOZCAS－SPEX－Ⅱ和草地贪夜蛾［Spodoptera frugiperda （Smith）］Sf 9细胞的增殖抑制活性，旨在从细胞水平上探讨几种植物源活性物质的杀虫活性及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

供试细胞：甜菜夜蛾中肠脂肪体细胞IOZCASSPEX－Ⅱ和草地贪夜蛾胚胎细胞Sf 9，本实验室培养（中国科学院动物研究所赠送）。IOZCAS－SPEX－Ⅱ细胞培养于 Hink’s TNM （Sigma，USA），Sf 9细胞培养于Sf－900TMII SFM （Invitrogen，USA）。培养基添加10% 胎牛血清（Invitrogen，USA），100U青霉素和100U链霉素。培养条件为（26±1）℃，RH70%～80%，每4～6d传代一次。

供试药剂、试剂及仪器：喜树碱（camptothecin）（99.17%）和羟基喜树碱 （hydroxycamptothecin）（99.44%）购买于四川南部县诚信科技有限公司；鱼藤酮 （rotenone）（95%）和 印 楝 素 （azadirachtin）（95%）购于美国Sigma公司；乌头碱（aconitine）、次乌头碱（hypaconitine）、伪石榴皮碱（pseudopelletierine）、马钱子碱（strychnine）和吴茱萸碱（evodiamine）为购于中国药品生物制品检定所的标准品；DMSO（英国Invitrogen公司；99.9%）、CellTiter 96®AQueous One Solution细胞增殖试剂盒购于美国Promega公司；HPS－160培养箱购于哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；TECAN infinite M200 pro酶标仪购于瑞典Tecan公司。

1.2 方法

1.2.1 植物源活性物质溶液配制

喜树碱、羟基喜树碱、乌头碱和马钱子碱分别溶于DMSO中配制1.0×104μmol／L，放在4℃冰箱保存；次乌头碱溶于DMSO中配制6.65×104μmol／L；吴茱萸碱溶于 DMSO 中配制5.6×104μmol／L；伪石榴皮碱溶于DMSO中配制1.142×105μmol／L，放在4℃冰箱保存，使用液用DMSO稀释至所需浓度。

1.2.2 植物源活性物质对昆虫细胞增殖的抑制作用

取对数生长期的IOZCAS－SPEX－Ⅱ 和Sf 9细胞，调整培养细胞浓度为105个／mL。根据CellTiter 96®AQueous One Solution试剂盒说明书，以每孔80μL接种96孔板，12h后，分别加入喜树碱、羟基喜树碱、乌头碱、次乌头碱、马钱子碱、吴茱萸碱、鱼藤酮和印楝素使其终浓度为1.0×10－3、1.0×10－2、1.0×10－1、1.0×100、1.0×101、1.0×102μmol／L，对照组加入 DMSO（1μL），每个浓度设3个平行孔。培养2、6、12、24、48、72h后，分别加入CellTiter 96®AQueous One试剂10μL，继续培养2h后，用酶标仪在490nm处测定吸光度，按下面公式计算细胞生长抑制率：

1.2.3 数据分析

采用Excel软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 几种植物源活性物质对Sf 9细胞增殖的抑制活性

如图1所示，喜树碱、羟基喜树碱和鱼藤酮对Sf 9细胞生长的抑制性明显高于其他植物源活性物质。在同一时间内，喜树碱、羟基喜树碱和鱼藤酮随着浓度的升高，对Sf 9细胞生长抑制性逐渐升高，说明喜树碱、羟基喜树碱和鱼藤酮对细胞毒性有明显的剂量效应。在同一浓度时，喜树碱、羟基喜树碱和鱼藤酮对Sf 9的抑制活性随着时间的改变也发生了变化，表明这3种植物源活性物质对Sf 9细胞的增殖抑制作用具有时间依赖性。而乌头碱、次乌头碱、伪石榴皮碱、马钱子碱、印楝素及吴茱萸碱在同一时间内，随着浓度的升高，对Sf 9细胞的生长抑制率总体上没有明显差异，但是这几种植物活性物质其对细胞均有一定的毒性。

2.2 几种植物源农药对IOZCAS－SPEX－Ⅱ细胞的增殖抑制活性

从图2可以看出：喜树碱、羟基喜树碱和鱼藤酮在同一时间内，随着浓度的降低，对甜菜夜蛾IOZCAS－Spex－Ⅱ细胞生长抑制率逐渐降低，细胞的生长存活率升高；同时，在同一浓度，随着时间的不断延长，喜树碱、羟基喜树碱和鱼藤酮12h与其他时间有着显著性差异，说明喜树碱、羟基喜树碱和鱼藤酮在12h中对细胞的抑制性达到了顶峰。喜树碱、羟基喜树碱和鱼藤酮对细胞的生长抑制性明显高于其他植物活性物质，这说明喜树碱、羟基喜树碱和鱼藤酮对细胞的毒性远远高于其他几种活性物质。而乌头碱、次乌头碱、伪石榴皮碱、印楝素、马钱子碱和吴茱萸碱在同一时间随着浓度的降低，甜菜夜蛾SPEX－Ⅱ细胞的生长抑制率没有明显的变化；同时，在同一浓度中，随着时间的不断延长，在12h中与其他时间存在着显著差异，这也说明其活性物质本身对细胞液有一定的毒性，从而产生抑制细胞生长的效果。

图1 不同植物活性物质在不同时间不同浓度对Sf 9细胞增殖的抑制作用Fig.1 Propagation inhibition of Sf 9cells by several plant－derived compounds on time and dosage scales

图2 植物活性物质对IOZCAS－SPEX－Ⅱ细胞增殖的抑制率Fig.2 Propagation inhibition of IOZCAS－SPEX－Ⅱ cells by several plant－derived compounds on time and dosage scales

3 讨论

随着生物技术的发展，细胞工程已经越来越受到国内外学者的重视。基于细胞水平的筛选具有靶标均质性好，试验条件容易控制等优点，利用24孔板、96孔板，使得待测化合物变得越来越微量化，筛选成本更低，筛选量更大，这对筛选化合物库中的活性物质具有重要的意义。Stipanovic等［4］测定了棉酚系列天然产物对烟芽夜蛾［Heliothis virescens（Fabricius）］细胞系的毒力，试验结果与活体毒力测定和田间小区试验有良好的相关性。张志祥等［5］利用MTT法对19种茼蒿素类似物进行了离体细胞筛选，取得了良好的试验结果。

本试验采用在不同时间不同浓度下，测定不同植物源活性物质对甜菜夜蛾IOZCAS－SPEX－Ⅱ和草地贪夜蛾Sf 9细胞的增殖抑制性。在本试验体系（100μL）中，DMSO使用剂量均为1μL，在测定的时间范围内（2、6、12、24、48、72h），该剂量下 DMSO对两种昆虫细胞的增殖抑制率范围均为3%～5%。结果表明，喜树碱、羟基喜树碱和鱼藤酮对昆虫细胞的增殖具有良好的抑制作用，并且具有时间和剂量效应。乌头碱、次乌头碱、伪石榴皮碱、印楝素、马钱子碱和吴茱萸碱对IOZCAS－SPEX－Ⅱ和草地贪夜蛾Sf 9细胞也具有一定的毒性，但是不具有明显的剂量效应。如乌头碱、次乌头碱、伪石榴皮碱、马钱子碱和吴茱萸碱对Sf 9细胞毒性结果出现随着剂量升高抑制效果下降，一定程度的波动现象，但不具有显著的剂量关系，这可能与试验存在一定的误差，设置浓度极差较大，植物源活性物质具有不同的作用机制有关。昆虫细胞离体筛选的主要是呼吸抑制剂、核酸与蛋白质合成抑制剂等，而对于其他作用方式的化合物，则很难直接利用离体细胞进行测定。如有神经毒性的化合物，由于细胞中没有神经突触，化合物在细胞体系中因找不到相应的靶点而毒力相对较低，甚至表现为无毒，有时可能会漏筛一些具有高活性的化合物［6－7］。因此，基于离体细胞的生物测定，可以作为活体筛选的补充手段，同时也可作为一种药物作用机理研究的有效工具。

［1］ 周青春，万树青，刘钊杰.利用MTT法测定杀虫剂对细胞的毒力［J］.植物保护学报，1996，23（4）：343－348.

［2］ 邱立红，张文吉，王成菊，等.高通量筛选在新农药创制研究中的应用［J］.农药科学与管理，2002，23（5）：20－25.

［3］ Jensen N A，Gerth K，Grotjohann T，et al.Establishment of a high content assay for the identification and characterization of bioactivities in crude bacterial extracts that interfere with eukaryotic cell cycle［J］.Journal of Biotechnology，2009，140（1－2）：124－134.

［4］ Stipanovic R D，Elissalde M H，Altman D W，et al.Cell culture bioassay to evaluate allelochemical toxicity to Heliothis virescens （Lepidoptera：Noctuidae）［J］.Journal of Economic Entomology，1990，83（3）：737－741.

［5］ 张志祥，徐汉虹，程东美，等.利用MTT法以茼蒿素类似物对昆虫细胞毒力筛选及测定［J］.华南农业大学学报，2000，21（3）：29－32.

［6］ 徐红星，俞晓平，陈建明，等.杀虫剂离体细胞生物测定研究［C］∥杨怀文.第三届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会暨第二届全国生物农药研讨会论文集.北京：中国学术期刊电子杂志社，2004：227－230.

［7］ 郑丙莲，杨红，洪华珠，等.八种昆虫离体细胞系对灭多威农药的敏感性研究［J］.生物技术通报，2000（5）：30－36.