一种改良的快速提取小型昆虫总RNA的方法

高 阳， 朱春晖， 谭新球，刘 勇， 彭 静， 张德咏＊

（

1.湖南省植物保护研究所，长沙 410125；2.园艺作物病虫害治理湖南省重点实验室，长沙 410125；3.中南大学研究生院隆平分院，长沙 410125）

随着许多重要农业昆虫如蚜虫等小型昆虫全基因组的测定，昆虫基因改造和转录组研究的日趋深入，RNA的提取越来越成为昆虫分子生物学操作的关键环节。然而许多重要农业昆虫如烟蚜、烟粉虱和西花蓟马个体较小，蛋白质含量高，RNA含量少，提取困难。目前常用的昆虫RNA提取方法有试剂盒法、CTAB 法、Trizol法、SDS－KAC－热酚法［1］、改进的一步法［2］等，但这些方法都有一定缺陷，如费用高、操作步骤多、提取耗时长等。

对于小型昆虫来说，能否有效地去除蛋白质和几丁质、尽可能减少RNA损失是提取高质量RNA成败的关键。硅粒吸附法是一种有效的RNA提取方法，由于其操作简便、安全性高并且稳定性好等优点，被广泛地应用于植物组织和病毒的总RNA提取［3－4］。本文对该方法进行了适当的改进后，应用于烟蚜、烟粉虱和西花蓟马总RNA的提取。现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

本试验使用的材料为烟蚜［Myzus persicae（Sulzer）］、烟粉虱 Q 隐种［Bemisia tabaci（Gennadius）Q sibling species］和西花蓟马［Frankliniella occidentalis（Pergande）］的活体成虫，采集于湖南省农科院植物保护研究所温室内。

1.2 试剂

异硫氰酸胍购自BIO BASIV INC，聚乙烯吡咯烷酮P－40（PVP－40）和二氧化硅（SiO2）购自Sigma公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司，水饱和酚（pH＜5.2）购自BoMei公司，其他均为国产分析纯化学试剂。研磨缓冲液（GB）、洗涤缓冲液（WB）、10%月桂酰肌氨酸钠溶液（NLS）、NaI溶液和硅粒悬浮溶液均按照文献方法［2］制备。

1.3 RNA提取方法

1.3.1 改良的硅粒吸附法

参照张德咏等［3］方法并改进。取烟蚜虫体20头（烟粉虱Q隐种和西花蓟马100头），用ddH2O漂洗，吸水纸吸干后放入1.5mL灭菌离心管中，加入500μL GB和100μL NLS（10%）溶液，用高压灭菌的一次性研磨棒进行研磨。随后70℃温浴10min，不时摇动。冰上放置5min后离心10min（13000r／min）。取500μL上清液，加入等体积水饱和酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），摇动混匀后，室温下离心5min（12000r／min）。取上清液，加入150μL无水乙醇，300μL NaI，25μL硅粒悬浮溶液，室温下不停摇动10min。离心1min（6000r／min），倒掉上清液。加500μL WB洗涤2～3次（充分悬浮至上清液中无漂浮的硅颗粒为止），每次6000r／min离心1min。沉淀加ddH2O 75μL，70℃温浴4min后离心3min（13000r／min），取上清50μL，－20℃保存。

1.3.2 Trizol法

取烟蚜虫体20头（烟粉虱Q隐种和西花蓟马100头）放入1.5mL灭菌离心管中，在液氮保护下用高压灭菌的一次性研磨棒进行研磨。加入1mL Trizol试剂进行裂解，在室温下放置5min后加入0.2mL氯仿，充分混匀，在室温下放置2min，离心15min（4℃，12000g）；取上层水相，加0.5mL异丙醇，在室温下放置10min，离心10min（4℃，12000g）；弃上清，加1mL 75%乙醇进行洗涤离心5min（4℃，7500g），弃上清；沉淀的RNA在室温下自然干燥；用50μL DEPC水溶解RNA沉淀，－70℃保存。

1.3.3 改进的一步法

取烟蚜虫体20头（烟粉虱Q隐种和西花蓟马100头），参照景天忠等［2］的方法进行，最后用50μL DEPC水溶解RNA沉淀，－70℃保存。

1.4 总RNA琼脂糖凝胶电泳检测

从总RNA提取物中取5μL，与2μL 6×loading buffer和3μL SYBR GreenⅠ荧光染料混合后，在2.0%的琼脂糖凝胶中电泳20min（电压140V）。用FluorChem FC2凝胶成像系统（Alpha Innotech，USA）拍照检测。

1.5 总RNA紫外分光光度计检测

分别取烟蚜RNA提取物10μL，烟粉虱Q隐种和西花蓟马RNA提取物各20μL，加ddH2O稀释到500μL，用TU－1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析）测定其在230、260和280nm的吸光度，对RNA的纯度进行评估。

1.6 RT－PCR反应检测RNA的质量

取1μL烟蚜、烟粉虱Q隐种和西花蓟马的RNA，用两步法做 RT－PCR，根据已有文献［5－7］设计3对引物（由华大基因合成），如表1所示。其中烟蚜、烟粉虱Q隐种和西花蓟马扩增目标条带的长度分别为900、230和180bp。

表1 三种小型昆虫RT－PCR引物Table 1 All primers used for RT－PCR

RT－PCR反应条件：

第一链的合成：取昆虫总RNA 9μL，加1μL 3′端引物（20μmol／L）；保温5min；取出后迅速放到冰上，加入配好的反转录体系混合液，（2000U反转录酶1μL，2mmol／L dNTPs 2μL，5×反转录酶缓冲液5μL，灭菌ddH2O 17μL）；使用 PCR 仪于42℃反应50min。

第二链的合成：以第一链为模板进行PCR反应，反应体系如下：10×反应缓冲液2.0μLdNTP混合物（10mmol／L）0.4μL，5′端 引 物 （10μmol／L）1.0μL，3′端引物（10μmol／L）1.0μL，模板1.0μL，Taq DNA聚合酶，5U／μL 0.4μL，加灭菌ddH2O至终体积为20μL。

PCR反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性45s；55～56℃退火50s；72℃延伸1min；步骤2～4循环30次；72℃延伸10min，4℃保存。

1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，用FluorChem FC2（Alpha Innotech，USA）凝胶成像系统拍照检测扩增结果，烟蚜RPS2扩增产物送华大基因测序。

2 结果与分析

2.1 总RNA的质量比较

用改进的一步法、改良的硅粒吸附法和Trizol法等3种方法提取3种小型昆虫总RNA（图1），结果表明3种方法中改良的硅粒吸附法提取的RNA损失最小，条带最清晰，完整性较好。而且改良硅粒吸附法提取的3种昆虫总RNA电泳条带清晰无弥散，28SrRNA和18SrRNA的亮度接近2∶1，说明改良硅粒吸附法提取的RNA无降解，质量较好，可用于小型昆虫的总RNA提取。

图1 三种方法提取三种昆虫的总RNA（5μL）Fig.1 The RNAs of three insects extracted by three methods

2.2 RNA浓度、纯度及产率检测

通过紫外分光光度计检测3种方法提取的3种昆虫总RNA，结果如表2所示。由表2可见，改良的硅粒吸附法所得的3种昆虫总RNA A260／A280值都在1.8以上，蛋白质污染相对较少。另外A260／A230值都接近2.0，说明其他污染也较少。

表2 三种昆虫的RNA纯度及浓度Table 1 The purity and concentration of RNA extracted from three insects

与常规的改进的一步法和Trizol法等方法相比，改良的硅粒吸附法提取的3种昆虫总RNA产率略高，说明该方法是一种较好的提取昆虫总RNA的方法。

2.3 PCR检测

用改良的硅粒吸附法提取的3种昆虫总RNA作为模板同时进行两步法RT－PCR反应和普通PCR反应，经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果（见图2）表明：3种昆虫的RT－PCR产物条带单一，且与预期的大小一致。试验中以RNA为模板进行PCR以及CK对照均无目标条带。其中烟蚜RT－PCR产物测序后进行同源性分析，结果表明，本研究扩增得到的片段与文献中烟蚜RPS2基因序列（登录号：XM＿001945112）同源性为96.46%。该结果说明：此方法提取的总RNA可以用于RT－PCR。

图2 电泳检测结果

3 讨论

硅粒吸附法是一种快速、高效和经济的植物总RNA提取方法［4］，本文对其进行改良后应用于小型昆虫总RNA提取。由于烟粉虱等小型昆虫个体小，RNA含量少，蛋白质含量高，本试验对材料的研磨破碎过程进行了简化，同时增加了水饱和酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）对蛋白质的抽提。试验结果显示，不使用水饱和酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）对蛋白质进行抽提，基本得不到RNA产物，原因是昆虫蛋白质的存在会黏附硅颗粒，使其失去作用而导致试验失败。

试验发现，使用改良的硅粒吸附法提取的小型昆虫RNA稳定性好，试验所用到的试剂用灭菌ddH2O配制即可。采用本方法提取的RNA稳定的原因可能是硅粒对RNA的特定吸附作用，同时配合RNA酶的强抑制剂，使提取的RNA中的RNA酶去除得非常干净。此外，试剂中的聚乙烯吡咯烷酮P－40（PVP－40）最好不要用PVP系列的其他产品代替，否则提取的RNA纯度会受到影响（结果未显示）。

与传统的Trizol法和改进的一步法相比，改良的硅粒吸附法是一种经济高效的小型昆虫总RNA提取方法，RNA产率高，纯度佳。同时由于减少了挥发性有毒试剂DEPC的使用，本方法对实验人员的毒害性大大降低。

综上所述，改良的硅粒吸附法提取的小型昆虫总RNA质量好，完整性高，能够满足RT－PCR试验的要求。另外，整个试验操作简单、省时，所用试剂普遍、廉价，是提取小型昆虫总RNA的理想方法。

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