柑橘皮乙醇提取物中抑菌成分的分离与鉴定

朱 蔚， 高旭晖， 秦金花， 张 梁

（农业部茶叶生物化学与生物技术重点实验室，合肥 230036）

柑橘是我国最重要的果品资源之一，柑橘在加工生产橘汁或生鲜食用时，约产生40%～50%的皮渣，这些皮渣中含有许多有用的成分［1］。目前国内外研究表明，柑橘含有丰富的黄酮类化合物，其具有抗氧化、抗癌作用，预防心血管疾病、抗炎、抗过敏作用，抗病毒、抑菌作用，还可以预防动脉粥样硬化和胆固醇的增加［2－4］。近些年来，对其在防治农业病原菌方面的作用日益得到重视。研究发现：柑橘皮粗提物中的黄酮类和柠檬苦素类物质均具有抑菌效果［5－7］。严赞开［8］等研究了橘皮中橙皮苷对食品常见污染菌有广谱的抑菌作用。赵宝玉［9］等研究发现：橘皮乙醚、丙酮、乙醇3种溶剂提取物对5种霉菌均有不同程度的抑制作用。李凌绪［10］等证实了橘皮石油醚、乙酸乙酯、乙醇的提取物对7种农业植物病原真菌具有明显的抑菌活性。孙崇德［11］研究证明柑橘中提取的柠檬苦素和诺米林对青霉和黑曲霉两种真菌的抑菌效果明显，而对细菌生长的抑制作用非常微弱。目前，国内外对柑橘皮的抑菌活性研究较多，但其对茶树病原菌的研究少见报道。鉴于此，本文对柑橘皮乙醇提取物中的抑菌物质进行了分离鉴定，并就这些物质对茶云纹叶枯病病原菌的抑制作用进行了研究。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试原料

为市售新鲜柑橘（产地为江西婺源），剥皮后自然晾干，粉碎备用。

1.1.2 供试病原菌

茶云纹叶枯病（Colletotrichum camelliae Massee）病叶从安徽农业大学茶业系实验茶园内采集，分离，经显微观察鉴定为茶云纹叶枯病病原菌的分生孢子，经单孢分离获得纯培养。

1.1.3 供试试剂

硅胶：柱层析（100～200目，200～300目），硅胶薄层板（GF254）均为青岛海洋化工厂出品；凝胶：Sephadex LH－20为Pharmacia公司出品；溶剂：石油醚、氯仿、甲醇、乙酸乙酯、甲酸、正丁醇、二甲基亚砜（DMSO）、氘代氯仿为国产分析纯；显色剂：98%浓硫酸－乙醇溶液（V／V＝5∶95）；农药：75%百菌清可湿性粉剂；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。

1.2 试验方法

1.2.1 抑菌活性物质分离

称取一定量晾干的柑橘皮，粉碎后用95%乙醇加热至50℃超声提取3次，每次3h，将3次提取液混合，离心取上清液，减压浓缩回收溶剂后得31.95g浸膏。称取乙醇提取物浸膏10g，溶于100mL水，即乙醇提取物浓度为100mg／mL，依次用石油醚（60～90℃）、二氯甲烷、正丁醇萃取，减压浓缩后得石油醚部位浸膏8mg，二氯甲烷部位浸膏11.2mg，正丁醇部位浸膏200mg，水部位浸膏110.4mg。

1.2.2 乙醇提取物柱层析分离

另称取乙醇提取物5g用少量混合溶剂溶解，加入100～200目硅胶均匀拌样，挥干溶剂后，用硅胶（100～200目）湿法装柱进行层析分离，以氯仿－甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱（2∶0～0∶2，V／V），等样法接样每次接50mL。经薄层层析指导合并，减压浓缩得到5个不同极性段组分：Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4Fr.5 用氯仿－甲醇（1∶1 对Fr.31.5g 进行Sephadex LH－20凝胶柱色谱，得到流分JP－EtoH－1（橘皮的乙醇部分1）及Fr.3′，用氯仿－甲醇（1∶1）对Fr.4进行Sephadex LH－20凝胶柱色谱，得到流分JP－EtoH－2及Fr.4′，用氯仿－甲醇（1∶1）对JP－EtoH－2（400mg）进行Sephadex LH－20凝胶柱色谱分离，得到化合物Ⅰ；用氯仿－甲醇（1∶1）对JP－EtoH－1进行Sephadex LH－20凝胶柱色谱，再用氯仿－甲醇（15∶1）进行反复硅胶柱色谱，得到化合物Ⅱ；将流分Fr.3′和Fr.4′混合，用石油醚－乙酸乙酯（4∶5）、纯氯仿进行硅胶柱色谱，得到流分JP－EtoH－6、JP－EtoH－7、JP－EtoH－8、JP－EtoH－9。用氯仿－甲醇（1∶1）对JPEtoH－8进行Sephadex LH－20凝胶柱色谱，得到化合物Ⅲ；用氯仿－甲醇（1∶1）对JP－EtoH－6进行Sephadex LH－20凝胶柱色谱，再用氯仿－乙酸乙酯（25∶1）进行硅胶柱色谱，再用氯仿－甲醇（1∶1）进行Sephadex LH－20凝胶柱色谱纯化，得到化合物Ⅳ。用氯仿－甲醇（100∶1）对Fr.1进行硅胶柱色谱，再进行Sephadex LH－20凝胶柱色谱，分离得到化合物Ⅴ。

1.2.3 4种萃取物抑菌活性测定

采用生长速率法［12～13］对柑橘皮萃取物进行抑菌活性测定。将4个部位萃取物分别全部溶解于10mL丙酮，即石油醚部位最高浓度为0.8mg／mL、二氯甲烷部位最高浓度为1.12mg／mL、正丁醇部位最高浓度为20mg／mL、水部位最高浓度为11.04mg／mL，然后采用倍半稀释法分别将4个萃取部位用丙酮稀释配制成由高浓度到低浓度的浓度梯度共5个梯度。取1mL配制好的萃取物，与培养基混匀制成含药的平板。4种溶剂萃取物各为1处理，丙酮为对照，共设5个处理，每处理重复3次。用直径为6mm的打孔器打成大小均一的菌饼，将菌饼菌丝面向下接种于含药平板中央。接好菌种后置于28℃条件下培养，测量菌落直径（十字交叉法量2次，取其平均数）并用下列公式计算菌丝生长抑菌率。

1.2.4 5种化合物抑菌活性测定

孢子悬浮液制备：取培养10d的菌种，逐渐加入适量的无菌水，振荡，即获得孢子悬浮液，借助血球计数板镜检，配成浓度为1.3×106cfu／mL的菌悬液。

采用抑菌圈法 对化合物进行抑菌活性测定。采用倍半稀释法将样品用DMSO稀释配制成由高浓度到低浓度的浓度梯度（1000、500、250、125、62.5μg／mL）共5个梯度。用DMSO溶液作为阴性对照，75%百菌清可湿性粉剂为阳性对照。用微量移液器吸取60μL菌液于平板，用无菌“L”型玻棒在平板上均匀密集划线，待菌液干燥后，用外径6mm的打孔器打孔，每孔加药液20μL，平放在28℃真菌培养箱培养观察结果，测量抑菌圈直径。抑菌圈直径取两次试验结果的平均值。

2 结果与分析

2.1 化合物结构鉴定

化 合 物Ⅰ 黄 色 粉 末，1H－NMR（500MHz，CDCL3）δ：7.86（2H，d，j＝8.5Hz，H－2′，6′），7.01（2H，d，j＝9Hz，H－3′，5′），6.59（1H，s，H－3），4.09（3H，s，OCH3），4.01（3H，s，OCH3），3.94（6H，s，2×OCH3），3.87（3H，s，OCH3），该化合物与文献［15］5，6，7，8，4′－五甲氧基黄酮一致，鉴定化合物Ⅰ为5，6，7，8，4′－五甲氧基黄酮。

化合物Ⅱ 浅黄色结晶，1H－NMR（500MHz，CDCL3）δ：12.54（1H，s，OH－5），7.58（1H，d，J＝7Hz，H－6′），7.43（1H，s，H－2′），7.00（1H，d，J＝8.5Hz，H－5′），6.62（1H，s，H－3），4.11（3H，s，OCH3），3.98（6H，d，2×OCH3），3.96（3H，s，OCH3），3.90（3H，s，OCH3），该化合物与文献［15］5－羟基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黄酮一致，鉴定化合物Ⅱ为5－羟基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黄酮。

化合 物 Ⅲ 黄 色 粉 末，1H－NMR（500MHz，CDCl3）δ：7.57（1H，d，J＝8Hz，H－6′），7.42（1H，s，H－2′），6.99（1H，d，J＝8.5Hz，H－5′），6.64（1H，s，H－3），4.11（3H，s，OCH3），4.03（3H，s，OCH3），3.98（3H，s，OCH3），3.97（3H，s，OCH3），3.96（6H，s，2×OCH3），该化合物与文献［16］5，6，7，8，3′，4′－六甲氧基黄酮一致，鉴定化合物Ⅲ为川陈皮素。

化 合 物 Ⅳ 浅 黄 色 粉 末，1H－NMR（500Mz，CDCl3）δ：7.50（1H，d，J＝x8.5Hz，H－6′），7.33（1H，d，j＝1.5Hz，H－2′），6.98（1H，d，J＝8.5 Hz，H－5′），6.80（1H，s，H－3），6.60（1H，s，H－8），4.00（9H，t，3×OCH3），3.97（3H，s，OCH3），3.94（3H，s，OCH3）该化合物与文献［15］5673′4′－五甲氧基黄酮一致，鉴定该化合物Ⅳ为5，6，7，3′，4′－五甲氧基黄酮。

化合物Ⅴ 白色针状结晶，1H－NMR（500MHz，C5H5N）δ：4.29（1H，d，J＝3.5Hz，H－1），3.05（1H，d，J＝16.5Hz，Ha－2），3.19（1H，dd，J＝3.5，16.5Hz，Hb－2），2.62（1H，dd，J＝3.5，15.0Hz，H－5），2.54（1H，dd，J＝3.5，15.0Hz，Ha－6），3.24（1H，t，J＝15.0Hz，Hb－6），2.78（1H，dd，J＝2.5，12.0Hz，H－9），1.83（1H，m，Ha－11），1.97（1H，m，Hb－11），1.33（1H，m，Ha－12），1.84（1H，m，Hb－12），4.63（1H，s，H－15），5.73（1H，s，H－17），1.26（3H，s，CH3－18），4.69（1H，d，J＝13.5Hz，Ha－19），5.21（1H，d，J＝13.5Hz，Hb－19），7.71（1H，t，J＝1.0Hz，H－21），6.52（1H，dd，J＝1.0，1.5 Hz，H－22），7.63（1H，dd，J＝1.0，1.5Hz，H－23），1.18（3H，s，CH3－28），1.24（3H，s，CH3－29），1.26（3H，s，CH3－30），该化合物与文献［17］柠檬苦素一致，鉴定化合物Ⅴ为柠檬苦素。

2.2 4种溶剂萃取物的抑菌活性

由表1可知，当石油醚部位浓度为0.8mg／mL，其对茶云纹叶枯病病原菌的抑制率达80.9%；当二氯甲烷部位浓度为1.12mg／mL时，其对茶云纹叶枯病病原菌的抑制率为60.6%；而正丁醇部位和水部位对病原菌的抑菌活性较低。由此可见，柑橘皮乙醇提取物抑菌活性成分主要集中在石油醚部位和二氯甲烷部位。

表1 4种萃取物对茶云纹叶枯病病原菌的抑菌活性Table 1 Fungicidal activity of four kinds of extracts against mycelium growth of C.camelliae

2.3 石油醚和二氯甲烷萃取部分对病原菌的毒力

由表2可知，柑橘皮乙醇提取物的石油醚部位对茶云纹叶枯病病菌的抑制效果最好，EC50为0.1638mg／mL；其次为二氯甲烷部位，EC50为0.7643mg／mL。

表2 石油醚和二氯甲烷萃取部位对茶云纹叶枯病病原菌的毒力Table 2 Antifungal virulence of petroleum ether partition and methylene dichloride partition against mycelium growth of C.camelliae

2.4 柑橘皮乙醇提取物5种化合物对茶树云纹叶枯病病原菌的抑菌效果

由表3可知，当供试浓度为1000μg／mL时，柑橘皮乙醇提取物5个化合物中5－羟基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黄酮和柠檬苦素对茶云纹叶枯病原菌有很好的抑制作用，抑菌直径分别达13.47和16.05mm，见表3。

表3 柑橘皮5种化合物对茶树云纹叶枯病原菌的抑菌直径Table 3 The diameters of inhibition zones of five compounds against C.camelliae

3 讨论

研究结果表明，柑橘皮乙醇提取物中石油醚部位和二氯甲烷部位对茶云纹叶枯病病原菌有较好的抑制效果，抑制率分别达80.9%和60.6%；生长速率法测定石油醚部位对茶云纹叶枯病病原菌的EC50为0.1638mg／mL。这说明，柑橘皮的抑菌成分主要集中在小极性部位。本研究对柑橘皮乙醇提取部位进行了分离，发现了5个主要化合物，其中柠檬苦素和5－羟基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黄酮对茶云纹叶枯病原菌的抑制作用较强，这些初步结果可为植物源农药的开发和利用提供依据。

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