水貂肠道枯草芽孢杆菌的分离及16S rRNA鉴定

魏亚松，邹 玲，温建新，刘文华，邵 峄

（1.青岛农业大学 动物科技学院，山东青岛 266109；2.青岛安普动物营养品制造有限公司，山东青岛 266061）

长期以来，饲料中添加抗生素等添加剂虽对预防畜禽疾病有明显的作用，但随着抗生素的普及甚至滥用，造成病菌产生耐药性、药物残留及环境污染等诸多不利影响，直接危害人类健康。在这种情况下，益生菌作为一种无毒、无害、无残留、无抗药性的绿色饲料添加剂，就已成为动物疾病防治的一个新方向[1]。欧洲许多国家已禁止使用抗生素作为促生长剂，因此寻求无毒副作用、无药物残留的微生态饲料添加剂已成为研究热点[2-3]。

枯草芽孢杆菌是农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，其制剂为无毒、无残留、无污染的绿色添加剂。据雷爱莹等报道[4]其具有改善消化道内环境、促进动物生长、提高动物机体免疫力及产生多种酶类、提高消化酶活性等功能而备受青睐，故具有广阔的发展前景。据李俊波报道[5]在蛋鸡日粮中添加枯草芽孢杆菌制剂具有改善料蛋比、降低死淘率和鸡蛋破损率，并且显著提高了日粮粗蛋白和有机物消化率。温海燕和雷爱莹等报道[3-4]其在饲料添加剂、污水处理、疫苗载体等各方面已经得到了广泛的应用，显示了巨大的社会效益和生态效益。

枯草芽孢杆菌在养殖业中发挥巨大作用，已经得到广泛的应用[6]。大部分都是针对鸡、猪、水产等的，很少见有资料报道在水貂等特种经济毛皮动物中。本试验从健康水貂肠道中分离鉴定枯草芽孢杆菌，以期为进一步深入研究提供参考，并为水貂等毛皮动物的微生态制剂应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 健康成年丹麦红眼母貂。

1.1.2 培养基 普通营养琼脂和营养肉汤培养基均购自北京奥博星生物技术公司。

1.1.3 主要试剂 革兰氏染色液、5%孔雀绿染液、0.5%沙黄溶液、糖醇发酵管（葡、麦、蔗、乳、甘、木、果、七叶苷等）、硝酸盐还原试验甲液和乙液、3%过氧化氢、明胶、碘液等。DNA提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；TE缓冲液，Premixed Taq（incl dye）、DL 2000 DNA Marker、电泳级琼脂糖Agarose Regular购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.4 主要仪器 恒温培养箱、恒温振荡器、高压蒸气灭菌锅、光学显微镜、电子天平、DYY-Ⅲ-7型电泳仪、AlphaView S A凝胶成像分析仪和721型紫外分光光度计等。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集与处理 取肠黏膜和粪便样品1 g，置于含有PBS缓冲液的三角瓶（含玻璃珠）中，取上清液加入离心管离心，2000 r/min离心10 min，置于80℃的水浴锅内水浴30 min[7-8]。

1.2.2 菌株的分离纯化 取菌液接种于普通培养基平板上，置于37 ℃恒温箱培养18 h；挑取疑似菌落进行纯化培养。

在折腾了两天以后，我被三根高大杉木支起的一个葫芦瓜子滑轮牵引扯出了地面。他们锯掉我四周伸张的树根，把带土的根部用草要子缠绕包裹起来，并在上面洒了水，以保持我基本的生存需求。

1.3 染色镜检

1.3.1 革兰氏染色 挑取单菌落，在载玻片上进行抹片，待其干燥固定后，进行革兰氏染色，镜检。

1.3.2 芽孢染色 挑取单菌落，抹片经火焰固定后滴加5%孔雀绿水溶液加热30～60 s使其产生蒸汽4次，水洗；滴加0.5%沙黄液1 min，水洗吸干镜检[9]。

1.4 生理生化试验 按照常规实验方法[9-10]对分离菌进行糖苷醇发酵试验、甲基红（MR）试验、乙酰甲基甲醇试验（VP试验）、淀粉水解试验、吲哚试验、TSI试验、脲酶试验、柠檬酸盐利用试验、触酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验等生理生化试验，置于37 ℃恒温培养18 h，观察结果。

1.5 16 S rRNA的PCR扩增和序列分析

将分离的菌株接种于5 mL营养肉汤中培养，取4 mL菌液10000 r/min离心2 min，参考《精编分子生物学室验指南》[11]的方法提取DNA。

在参考了国内外相关文献[12-14]后，确定一对芽孢杆菌属特异性引物：正向引物Primer A：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，反向引物Primer B：5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3'，由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR产物经试剂盒纯化后，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。测序结果使用DNAStar7.1软件包中的SeqMan进行序列拼接。采用BLAST和与GenBank数据库中已收录的芽孢杆菌属16 S rRNA的序列比对，并使用MegAlian中的Clustal X Method进行同源性比较[16-17]。

2 结果与分析

2.1 菌落形态和菌体形态结果

将从健康水貂肠道中分离的菌命名为P2。菌落呈灰白色、无光泽，表面粗糙，菌落边缘不整齐，为干燥型菌落（图1a）。革兰氏染色为阳性，菌体呈长杆状，芽孢中生，椭圆形（图1b）。芽孢染色，芽孢被染成绿色，菌体呈红色（图1c）。

2.2 生理生化试验结果

分离菌P2的生理生化试验结果见表1。

根据《伯杰细菌鉴定手册》[18]和《常见细菌系统鉴定手册》[19]，上述结果均符合枯草芽孢杆菌的生化特性，证明分离菌为枯草芽孢杆菌。

表1 P2菌的生理生化试验结果

2.3 PCR鉴定结果 对菌株P2进行芽孢杆菌属的PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示有特异性条带（图2），证明菌株P2为芽孢杆菌属。

将分离的P2菌株与其他14个从GenBank下载的国内外分离的芽孢杆菌属的基因序列进行同源性比较。结果显示比对的几个菌株的同源性均在99.0%～99.9%之间（图3）。由图3可知，P2菌株的核酸序列与Bacillus subtilis strain CICC 10023（GU980947.1）的同源性最高，达到了99.9%，因此该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌。

3 讨论

芽孢是某些革兰氏阳性菌在一些不适宜的条件下，在菌体内形成的一个圆形或卵圆形的休眠体。所以本试验采用将样品进行80 ℃高温处理30 min，然后进行分离筛选。此外，本试验凝胶电泳结果比预期的偏大些，但是PCR产物的测序结果却与预期扩增片段相符，这说明不能仅通过凝胶电泳图来判断结果，还需通过测序及序列分析确定结果。

本试验通过菌落形态观察、革兰染色、芽胞染色和生理生化特性方法对分离菌株的鉴定，与张红英等[20]从人工饲养的健康三黄肉鸡的盲肠和大肠中分离出了枯草芽胞杆菌的结果一致；本试验通过16S rRNA序列分析对分离菌株P2与从GenBank下载的国内外分离的芽孢杆菌属进行核酸序列的同源性比较，结果显示比对的几个菌株的同源性均在99.0%～99.9%之间；与周宏璐等[21]通过16S rDNA序列分析对从养猪场健康成年猪粪便中分离的1株芽孢杆菌进行鉴定，序列分析与枯草芽孢杆菌相似度为98.99%的结果相符。但在水貂肠道中，分离出枯草芽孢杆菌的报道尚属首次。

枯草芽孢杆菌广泛应用于养殖业，芽孢杆菌被制为活菌制剂已广泛应用于猪和家禽等动物以及水产养殖业中，但在毛皮动物特别是水貂养殖上，应用研究相对较少。枯草芽孢杆菌在大多数动物肠道中被认为是过路菌[22]，但在水貂肠道中分离出该菌，说明该菌对水貂有一定作用，具体机理有待于进一步研究。

4 结论

本研究从健康水貂的肠道中分离纯化出1株枯草芽孢杆菌，命名为P2，通过形态学观察、生理生化试验以及16 S rRNA序列分析进行综合鉴定。结果表明P2菌株菌落呈灰白色、边缘不整齐；革兰氏染色为阳性，菌体呈长杆状，芽孢中生，椭圆形；能够发酵葡萄糖、蔗糖、果糖等多种碳源；通过对菌株的扩增、测序和分析可知，显示菌株P2与菌株 Bacillus subtilis CICC 10023（GU980947.1） 亲缘关系最近，同源性达到了99.9%，因此鉴定P2菌株为枯草芽孢杆菌。

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