液相芯片与免疫组织化学方法检测非小细胞肺癌ERCC1和RRM1表达的比较研究

胡艳正 王 伟 尚立群 李学昌 文 锋 李 军刘军强

液相芯片与免疫组织化学方法检测非小细胞肺癌ERCC1和RRM1表达的比较研究

胡艳正①②王 伟②尚立群②李学昌②文 锋②李 军②刘军强②

目的：切除修复交叉互补基因1（exsicion repair cross-complementing group 1，ERCC1）和核糖核苷酸还原酶M1（ribonucleotide reductase M1，RRM1）的表达水平可预测非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）对化疗的敏感性。旨在评价免疫组织化学检测的蛋白水平与液相芯片检测的mRNA水平的临床应用价值。方法：采用免疫组织化学和液相芯片方法分别检测42例非小细胞肺癌组织中ERCC1、RRM1的蛋白表达和mRNA表达水平，非参数相关性分析二者表达的相关性。结果：两种方法检测的非小细胞肺癌组织中ERCC1和RRM1蛋白表达与mRNA表达的一致率分别为52.3%（22/42）和76.2%（32/42）；两种方法检测RRM1和ERCC1蛋白表达和mRNA表达呈正相关（r=0.778，P=0.010；r=0.277，P=0.076）。结论：免疫组织化学检测的RRM1和ERCC1的蛋白水平与液相芯片检测的mRNA水平具有较好的一致性和相关性，二种方法同时检测可以增加临床应用的敏感性和特异性。

非小细胞肺癌 切除修复交叉互补基因1 核糖核苷酸还原酶M1 免疫组织化学 液相芯片

肺癌是目前全球范围内死亡率最高的恶性肿瘤，全球每年新增病例达120万例，其中病理学确诊的肺癌中约有80%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）［1］。化疗是NSCLC的主要治疗方法，铂类和20世纪90年代以后的三代新药（吉西他滨、培美曲塞、紫杉醇等）为NSCLC公认的化疗药物。铂类抗癌作用的主要靶点为DNA，通过DNA-Pt-DNA结构形成DNA链内交联、链间交联或通过DNA-Pt-蛋白质形成DNA-蛋白交联，破坏DNA的正常结构，阻碍DNA的模板作用，进而抑制DNA的复制和转录，使增殖迅速的细胞停滞在G2/M期［2］。ERCC1过表达可使停滞在G2/M期损伤的DNA迅速修复，导致其对铂类耐药。吉西他滨是嘧啶类抗代谢药，作用于DNA合成期，通过干扰（RRM1）的功能而减少脱氧核苷酸的产生，最终影响DNA合成，RRM1过表达可导致其耐药［3］。由于不同个体肿瘤组织ERCC1和RRM1的表达不同，导致对吉西他滨和铂类药物的敏感性不同。检测肿瘤组织中ERCC1和RRM1表达可预测患者对GP（吉西他滨+铂类）化疗方案的敏感性，从而指导临床实施个体化化疗，避免耐药患者接受不必要的不良反应，提高治疗疗效，改善患者预后。

免疫组织化学检测ERCC1和RRM1的蛋白水平是目前临床常用的检测方法，近年来，液相芯片技术的发展及其多通路、高通量和实时数据分析等优点使其在检测基因mRNA水平具有潜在的临床应用价值。本研究分别采用免疫组织化学技术及液相芯片技术检测NSCLC患者原发癌组织标本中ERCC1和RRM1的表达情况，评价二者的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料

2011年4月至2012年6月行手术切除且病理证实为非小细胞肺癌的42例患者，男性29例、女性13例；年龄39～77岁，中位年龄57岁；鳞癌25例，腺癌15例，其他2例；病理分期Ⅰ期22例，Ⅱ期14例，Ⅲ期6例。所有患者术前均未接受任何针对肿瘤的治疗措施。

1.2 免疫组织化学法检测ERCC1和RRM1的蛋白表达

1.2.1 免疫组织化学检测 所有标本均经10%中性甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm切片，常规HE染色。免疫组织化学染色采用EnVision二步法，高温高压抗原修复，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，一抗室温2 h，二抗室温20 min，DAB显色，流水冲洗，苏木素复染，常规脱水透明后中性树胶封片。已知阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。鼠抗人ERCC1单克隆抗体（ab2356）和鼠抗人RRM1单克隆抗体（ab81085）为美国Abcam公司产品（1：100稀释），羊抗鼠/兔二抗检测试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司，一抗稀释液及DAB显色试剂购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2.2 结果判定 免疫组织化学阳性染色呈棕黄色颗粒，ERCC1定位于肿瘤细胞核，RRM1定位于细胞质。依据Olaussen等［4］的标准，根据染色程度和染色阳性细胞百分比进行评分。Olympus光学显微镜高倍镜下（×400）随机选择5个视野，每个视野记数100个细胞，以见到肿瘤细胞胞核或胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性标准。根据细胞染色程度和染色阳性细胞百分比进行评分。染色程度：基本不着色记0分，稀疏的棕色颗粒记1分，较多的棕黄色颗粒记2分，弥漫粗大的棕黄色颗粒记3分。将染色程度分级与着色阳性细胞占计数细胞百分比相乘得出H值（与下面的内容合并）。染色程度：基本不着色0分，稀疏的棕色颗粒1分，较多的棕黄色颗粒2分，弥漫粗大的棕黄色颗粒3分。将染色程度分级与着色阳性细胞占计数细胞百分比相乘得出H值。H值为0分为阴性（-）；0＜H值＜l为弱阳性（+），1≤H值＜2为中度阳性（++），2≤H值＜3为强阳性（+++）（图1，2）。

图1 免疫组织化学法检测NSLC组织中ERCC1蛋白表达（×400）Figure 1 ERCC1 expression tested by immunohistochemistry

图2 免疫组织化学法检测NSLC组织中RRM1蛋白表达（×400）Figure 2 RRM1 expression tested by immunohistochemistry

1.3 液相芯片法检测ERCC1和RRM1 mRNA表达

液相芯片检测：组织标本经75%乙醇固定，取适量样本加入裂解液（广州益善公司提供），56℃下裂解反应2 h，将组织裂解液转移至孵育板上，加入支持探针-微球、支持延伸探针、缓冲液，55℃震荡孵育过夜，次日将孵育板放在磁力架上1 min，加入洗涤液，震荡洗涤1 min，孵育板放在磁力架上1 min，弃去上清，重复3次，加入扩增延伸探针和标记探针，50℃震荡反应1 h，孵育板放在磁力架上1 min，弃去上清；洗涤液洗2次，加入链霉亲和素-藻红蛋白，50°震荡反应30 min，孵育板放在磁力架上1 min，吸取弃去上清；洗涤液洗2次，加入洗涤液，震荡5 min，待测物如ERCC1mRNA或RRM1mRNA在液相反应体系中与分子探针特异性结合后加入荧光标记，经液相悬浮反应后的乳胶颗粒被微量液体传送系统排成单列通过两束激光：一束判定颗粒的颜色从而决定被测物的性质（定性），另一束测定微粒上荧光标记强度从而决定被测物的量（定量）。所得到数据经电脑处理后可直接用来判定结果。

Luminex阅读仪显示为液相芯片微球中位荧光读数，经广州益善生物有限公司提供数据处理软件产生最终结果，根据ERCC1和RRM1表达水平依次分为低表达、中偏低表达、中表达、中偏高表达、高表达（表达程度判定参考益善检测人群数据库）（图3，4）。

1.4 统计学方法

应用SPSS13.0软件进行统计分析。免疫组织化学与液相芯片方法检测的肿瘤组织中ERCC1、RRM1表达的相关性分析采用Spearman秩相关分析。P＜0.05为有统计学差异。

图3 液相芯片法测定ERCC1表达，样本ERCC1中偏低表达Figure 3 ERCC1 expression tested by a suspension biochip；the figure shows an expression level that is less moderate

图4 液相芯片法测定RRM1表达，样本中RRM1中低表达Figure 4 RRM1 expression tested by a suspension biochip；the figure shows an expression level that is less moderate

2 结果

2.1 免疫组织化学检测NSCLC组织中ERCC1和RRM1蛋白表达

经免疫组织化学检测的42例组织样本中，ERCC1表达结果为（-）30例，（+）8例，（++）3例，（+++）1例；RRM1表达结果为（-）7例，（+）26例，（++）4例，（+++）5例（表1）。

表1 免疫组织化学检测NSCLL组织中ERCC1、RRM1蛋白表达状况 例Table 1 ERCC1 and RRM1 protein expression tested by IHC

2.2 液相芯片检测NSCLC组织中ERCC1和RRM1 mRNA表达

经液相芯片检测的肿瘤组织中ERCC1低表达21例，中偏低表达18例，中偏高表达2例，高表达1例；RRM1低表达9例，中偏低表达23例，中偏高表达4例，高表达6例（表2）。

表2 液相芯片检测ERCC1、RRM1 mRNA表达状况 例Table 2 ERCC1 and RRM1 mRNA expression tested by a suspension biochip

2.3 免疫组织化学检测的蛋白水平与液相芯片检测的mRNA水平的相关性

两种检测方法测定的NSCLC中ERCC1、RRM1蛋白及mRNA表达一致率分别为52.3%（22/42）和76.2%（32/42）；进一步相关性分析表明，两种方法检测的肿瘤组织中RRM1和ERCC1的表达水平呈正相关（r=0.778，P=0.010；r=0.277，P=0.076）。

3 讨论

ERCC1和RRM1均参与细胞内DNA损伤修复过程，目前已经有多个研究结果显示ERCC1和RRM1是NSCLC患者接受顺铂＋吉西他滨方案化疗疗效的预测指标。其中，RRM1的表达水平与NSCLC对吉西他滨的疗效呈负相关［5-6］，ERCC1高表达与铂类耐药相关［7-8］。检测ERCC1、RRM1表达水平对患者个体化化疗及生存预后具有重要意义。当前关于上述两个因子基因表达水平检测的方法主要有测序、荧光定量PCR及液相芯片技术，蛋白表达水平上的检测常用免疫组织化学技术。

IALT研究是第一个通过检测肿瘤标本中ERCC1蛋白表达水平来评估其临床意义的大规模临床试验，Olaussen等［9］采用免疫组织化学技术检测783例NSCLC患者肿瘤组织中ERCC1蛋白表达水平，将患者分为ERCC1表达阳性（335例，44%），ERCC1阴性（426例，56%）。ERCC1阴性的患者随机接受含铂方案辅助化疗生存时间明显延长（P=0.002），ERCC1阳性患者无论是否接受含铂方案辅助化疗，生存情况无统计学差异意义（P=0.40），因此认为手术完全切除的ERCC1阴性NSCLC患者更适合基于顺铂的辅助化疗。对于未予辅助化疗的患者，ERCC1阴性预示着较短生存期。RRM1是盐酸吉西他滨耐药的一个重要预测指标，Gao等［10］通过免疫组织化学法检测了75例晚期非小细胞肺癌患者组织中RRM1蛋白表达水平，发现RRM1蛋白低表达使用吉西他滨的化疗反应率及1年生存率均高于RRM1高表达者，因此认为RRM1蛋白表达水平与晚期非小细胞肺癌患者吉西他滨化疗有效率相关。

液相芯片是一种全新概念的生物芯片，该技术的核心是把微小的聚苯乙烯小球用荧光颜色的方法进行编码，然后将每种颜色的微球共价交联上针对特定检测物的探针、抗原或抗体，微球与待测样本在悬液中结合后通过两束激光分别识别编码微球和检测微球上报告分子的荧光强度进而获得待测样本浓度。液相芯片具有简单快速、敏感度好、特异性高、节省样本量、缩短分析时间、节约劳动力、检测费用低，以及多通路、高通量和实时数据分析等优点［11］。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析及受体与配体的识别分析等领域中。本研究使用广州益善公司提供的液相芯片分析平台，检测42例NSCLC组织中ERCC1、RRM1 mRNA表达水平，同时使用免疫组织化学法检测肿瘤组织中ERCC1、RRM1蛋白表达水平，发现两种检测方法检测的非小细胞肺癌RRM1表达一致率为88.5%（23/26）。进一步的相关性分析表明，两种方法测定的肿瘤组织中RRM1的表达水平有良好的相关性（r=0.793，P=0.01），即肿瘤组织中RRM1mRNA表达水平与组织中RRM1蛋白水平具有一致性。Giovannetti等［12］对12例胰腺癌冰冻切片中RRM1mRNA表达与RRM1免疫组织化学染色强弱进行对比，也发现了类似的结论：肿瘤细胞中RRMI免疫组化染色强弱与其基因表达相关，RRM1mRNA高表达者免疫组化染色强而弥漫，中等强度表达者染色较弱，而低表达者仅可见散在的肿瘤细胞弱染色。因此对于肿瘤组织中RMM1的表达，无论是使用液相芯片法检测其mRNA表达水平或是免疫组织化学技术检测RRM1蛋白表达，检测结果具有较好一致性，检测结果均可用于指导患者个体化化疗方案的确定及预后评估。两种检测方法测定的ERCC1表达一致率为57.7%（15/26），相关性分析表明，两者相关系数为0.249，两者虽有相关趋势，但由于病例数少，无显著统计学意义。Vilmar等［13］分别使用RT-PCT及免疫组织化学技术检测33例行手术切除的非小细胞肺癌组织样本中ERCC1mRNA及ERCC1蛋白表达水平，发现患者组织样本中ERCC1mRNA表达水平与ERCC1蛋白表达水平并无明显相关性，在进行预后分析时，将患者分为ERCC1蛋白阳性表达组及阴性表达组，ERCC1蛋白阴性患者总生存优于ERCC1蛋白阳性表达者，差异具有统计学意义，而基于ERCC1mRNA表达程度将患者分组却未得到类似结果。因此认为，检测技术不同，由此产生的分组状况不同，对患者生存预后的评估也就不同，因此有必要同时应用多种检测手段同时检测肿瘤靶标表达状况。

目前，国内外对非小细胞肺癌靶标对患者生存预后影响的研究中，分子标记物的检测大多是基于单一的免疫组织化学技术或基因扩增技术，从蛋白水平或基因水平检测分子靶标的表达，并以此为依据将患者分组进行生存预后评估。少有临床研究同时从蛋白水平及基因水平检测分子靶标的表达并分组进行临床预后评估。本研究使用免疫组织化学法及液相芯片法同时检测非小细胞肺癌组织样本中ERCC1、RRM1的表达，发现组织样本中ERCC1基因表达与ERCC1蛋白表达状况并不完全一致。前述Vilmar等［13］的研究也证实了这一点，原因可能为应用检测平台及检测标记物不同，免疫组织化学主要检测靶标蛋白水平的表达，而液相芯片检测靶标信使RNA的表达，从遗传信息的传递过程来解释，转录的信使RNA并不仅是翻译为有功能的蛋白质，鉴于本研究样本量少，且大多数为I期患者，部分患者术后无需进行辅助化疗，无法依据检测结果对患者分组进行化疗疗效及生存预后评估，可以肯定的是二种方法同时检测可进一步选择优势人群，增加临床化疗的敏感性和特异性。

ERCC1及RRM1作为非小细胞肺癌个体化治疗靶标对患者治疗及生存预后的指导意义已为众多文献所报告，本研究的意义在于发现了因检测技术不同所造成的靶标检测结果差异，并提出了依据检测结果对患者分组进行化疗疗效及生存预后评估的新课题。

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（2012-12-11收稿）（2013-02-04修回）

Suspension biochip versus immunohistochemistry for ERCC1 and RRM1 detection in non-small cell lung cancer

Yanzheng HU1,2,Wei WANG2,Liqun SHANG2,Xuechang LI2,Feng WEN2,Jun LI2,Junqiang LIU2

Wei WANG;E-mail:wangyr02@hotmail.com
1Third Clinical Medicine of Southern Medical University,Guangdong 510515,China
2Department of Thoracic Surgery,Naval General Hospital of PLA,Beijing 100048,China

Objective:With the treatment of non-small cell lung cancer(NSCLC)entering the era of individualization through the detection of expression levels of promising biomarkers in NSCLC tumor samples,tailored chemotherapy,and prognosis evaluation for NSCLC patients are now possible.This study focuses on two commonly utilized detection methods:immunohistochemistry(IHC)and suspension biochip.This study aims to determine the differences between IHC and suspension biochip with regard to the expression levels of biomarkers.Methods:Forty-two NSCLC patients were enrolled into the study from April 2011 to June 2012.The expression levels of excision repair cross-complementing group 1(ERCC1)and ribonucleotide reductase(RRM1)in the tumor samples were tested through IHC and suspension biochip,respectively.The statistical methods used in the analysis were were performed with the SPSS(version 17.0)statistical software;P＜0.05 was considered statistically significant.Results:The consistent rates of the ERCC1 and RRM1 expression levels tested by IHC and suspension biochip were 52.3%(22/42)and 76.2%(32/42),respectively.A significant correlationship was observed between IHC and suspension biochip in terms of the RRM1 expression levels(r=0.778,P=0.01).No such correlationship was found in the ERCC1 expression levels(r=0.277,P=0.076).Conclusion:The expression levels of RRM1 tested by the two methods exhibited good correlationship.The expression levels of the RRM1 mRNA in the NSCLC tissues were consistent with RRM1 protein expression.No significant correlationship was found in the expression levels of ERCC1 tested by the two methods.The expression levels of the ERCC1 mRNA in the NSCLC tissues were not always correlated with ERCC1 protein expression.The simultaneous use of IHC and suspension biochip can increase the sensitivity and specificity of chemotherapy.

NSCLC,ERCC1,RRM1,immunohistochemistry,suspension biochip

10.3969/j.issn.1000-8179.2013.06.012

①南方医科大学第三临床医学院（广州市510515）；②中国人民解放军海军总医院

王伟 wangyr02@hotmail.com

（本文编辑：杨红欣）