BAI-1在肾细胞癌组织中的表达定位及与VEGF MCD P53蛋白相关性研究

田大伟 孙 岩 杨宇明 汤 洋 雷鸣德 韩瑞发

BAI-1在肾细胞癌组织中的表达定位及与VEGF MCD P53蛋白相关性研究

田大伟 孙 岩 杨宇明 汤 洋 雷鸣德 韩瑞发

目的：探讨BAI-1在不同分期肾细胞癌中的表达差异以及BAI-1抑制肿瘤血管内皮增殖的机制。方法：取人肾细胞癌标本133例，正常肾组织标本133例（癌旁＞4 cm处正常肾组织，病理学检测证实）。正常肾脏标本为对照组，肾细胞癌标本为研究组。采用免疫组织化学SP法分别检测BAI-1、VEGF、MVD、P53，进行半定量统计学分析。取临床新鲜肾细胞癌组织标本27例，癌旁4cm以外肾组织15例。应用Western blot方法分析BAI-1肾细胞癌组织及正常肾组织中的表达差异。结果：免疫组化统计分析及western blot检测显示正常肾组织中BAI-1表达明显高于肾细胞癌组织，并且与临床分期相关，T1～2局限期肾细胞癌中BAI-1表达远高于T3～4进展期肾细胞癌（P＜0.05）。同时BAI-1表达与VEGF具有相关性（r=0.586，P＜0.05），与MVD具有相关性（r=0.577，P＜0.05），与P53表达具有相关性（r=0.513，P＜0.001）。结论：在肾细胞癌组织中BAI-1含量较正常肾组织明显降低且与肾细胞癌临床分期相关，BAI-1表达与VEGF、MVD负相关，与P53正相关性。BAI-1可能参与了肿瘤微血管增殖的负调节，BAI-1的表达减少可能与P53的突变相关。

BAI-1 肾细胞癌 P53VEGF 靶向治疗 MVD

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其发病率在泌尿系肿瘤中仅次于膀胱癌，位居第二位。2001年美国统计RCC的发病率比1950年上升12.6%，病死率上升36.5%，对于免疫、化学、放射治疗均不理想，目前手术治疗仍是其主要治疗手段，中晚期肾细胞癌手术后复发率、远处转移率很高。众所周知，肾细胞癌的特点是肿瘤内血管丰富，肿瘤生长、转移都依赖于血管的生长［1-2］。近年来针对这一特点，抑制肿瘤血管生长的靶向治疗被越来越多的人关注。

1997年Nishimori等［3］利用人脑胶质瘤研究具有功能的P53结合位点的靶基因时，分离出一种新的靶基因，其特异性表达于人的脑组织中，具有抑制血管生成的作用。因此命名为脑特异性新生血管抑制因子1（Brain-Specific Angiogenesis Inhibitor 1，BAI-1）。后续的研究发现BAI-1不仅仅在脑组织中存在，结肠、胃、肺、胰腺等组织中也发现了BAI-1的存在［4］。BAI-1属于G蛋白偶联受体的分泌素受体家族，Mori等［5］通过细胞培养基因转染发现BAI-1蛋白定位于细胞浆及细胞膜上，主要集中于细胞膜。有研究通过亲水性分析发现BAI-1蛋白是一种多重跨膜蛋白，N末端包含30个氨基酸残基的分泌型信号序列，下游有两种功能元件：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD），可以与整合素结合，而整合素可抑制由成纤维细胞生长因子诱导的血管生成［6］；5个血小板凝血酶敏感蛋白1（thrombospondin-1，TSP-1）［7］重复序列，TSP1为多肽类内源性新生血管抑制剂，主要通过TSRs与内皮细胞CD36分子的相互作用来抑制由成纤维细胞生长因子（FGF）诱导的新生血管生成［8］。因此BAI-1可能具有抗肾细胞癌血管内皮细胞增殖的作用，可成为新的抗肿瘤血管生成因子。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集天津医科大学第二医院泌尿外科2007年1月至2011年12月肾细胞癌根治术标本133例，其中对照肾组织133例为癌旁4 cm以外肾组织（病理学证实）。新鲜肾细胞癌标本27例，癌旁4 cm以外肾组织15例。患者年龄46～82岁，平均年龄56（56.13±13.98）岁。所有患者均为初治，术前均未进行化疗、放疗及其他保守治疗。所有肾细胞癌病例均已经过病理证实为透明细胞癌。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片3张，采用SP法染色，一抗为兔抗人BAI-1多克隆抗体，鼠抗人P53单克隆抗体（Abcam公司），兔抗人CD34多克隆抗体、兔抗人VEGF多克隆抗体（武汉博士德公司）。抗体稀释比均为1：100。以正常肾组织为对照组，按TNM（AJCC，2002）分期进行分组，分为2组：局限期肾细胞T1-2组101例，进展期肾细胞癌T3～4组32例。

1.2.2 Western blot 收集临床肾细胞癌根治术后标本27例 按TNM分期分为2组：局限期T1～2组23例，进展期T3～4组4例。癌旁＞4 cm处肾组织15例。分别检测组织中BAI-1的蛋白含量。用液氮冰冻组织样本提取蛋白并测定浓度。取蛋白20 μg行Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），6%的分离胶和5%的浓缩胶。电泳完成后，电转移法将蛋白转移到PVDF膜。5%脱脂奶粉的TTBS封存PVDF膜。加一抗BAI-1兔抗人多克隆抗体（Santa Cruz，1：500），4℃过夜。加HRP标记的二抗，室温孵育2 h。杂交膜用ECL化学发光试剂于暗室中显影并感光胶片。GAPDH作为内参。

1.2.3 结果判定标准 BAI-1、VEGF、P53、MVD免疫组化结果判定方法参考牟成金等［9］研究，综合细胞染色强度及阳性细胞占总细胞数的百分比，进行半定量分析。染色强度评分标准：不着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；阳性细胞比例评分标准：＜5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。每张切片读取10个视野的平均值，将细胞染色强度计分和阳性细胞比例计分相加，作为最后积分。根据最后积分，0～1分为（-），＞1分且≤3分为弱阳性（+），＞3分且≤5分为阳性（++），＞5分为强阳性（+++）。以（+～+++）为阳性（图1～2）。

1.3 统计学分析

用SPSS 17.0软件分析。使用χ2检验、Spearman相关分析法分析临床病理参数与免疫组化结果之间的相关性。假设检验的检验水准取α=0.05。以P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 不同肾组织中BAI-1（A、C、E）及 P53表达（B、D、F）Figure 1 Expression of BAI-1 and P53 in different renal tissues

图2VEGF（A、C、E）和MVD表达（B、D、F）Figure 2 Expression of VEGF and MVD in different renal tissues

2 结果

2.1 BAI-1在正常肾组织及肾细胞癌中的表达

正常肾脏中BAI-1含量明显高于肾细胞癌组织（P＜0.01，表1）。ROC曲线下面积（Area）=0.890，标准误（Std.Error）=0.020，P=0.000，95%CI：0.851～0.930，表明BAL-1的免疫组化结果对于肾细胞癌与正常组织的区分具有一定的诊断价值。Western blot检测结果与免疫组化结果完全一致，肾细胞癌组织中BAI-1蛋白的含量明显低于对应的正常肾组织，并且与肿瘤的TNM分期相关（图3）

2.2 BAI-1在不同临床分期及病理分级肾细胞癌中的表达差异

早期肾细胞癌中BAI-1含量明显高于晚期肾细胞癌（P＜0.05，表2，图4）。ROC曲线下面积（Area）=0.741，标准误（Std.Error）=0.051，P=0.000，95%CI：0.641～0.842，表明BAI-1的免疫组化结果对于肾细胞癌T1～2与T3～4的区分具有一定的诊断价值。

2.3 BAI-1表达与VEGF、MVD、P53的关系

通过统计学分析得出,133例肾细胞癌组织中BAI-1表达与P53正相关，与VEGF、MVD负相关（表3）。

图3 肾细胞癌和正常肾组织中BAI-1蛋白表达Figure 3 Expression of BAI-1 proteins in rienal cell carcinoma and normal renal tissues

图4 BAI-1对不同临床分期肾细胞癌的ROC曲线Figure 4 ROC curves for renal cell carcinoma in different clinical stages

表1 正常肾组织与肾细胞癌组织中BAI-1表达情况比较 n（%）Table 1 Comparison between the expression of BAI-1 in normal kidney tissues and renal cell carcinoma

表2 免疫组化检测不同分期肾细胞癌组织中BAI-1表达情况 n（%）Table 2 Expression of BAI-1 in renal cell carcinoma at different stages

表3 BAI-1与MVD、VEGF、P53的相关关系分析Table 3 Analysis of the correlation between BAI-1 and MVD and VEGF and between BAI-1 and P53

3 讨论

当肿瘤直径超过1～2 mm时，肿瘤生长所需的氧气和养分供应，主要依赖于新生血管的生长［10］。目前研究发现众多血管生成因子调控着肿瘤血管的新生，正调节因子包括血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子（TGF）、血管生长素（angionenin）等，负调节因子包括血小板反应蛋白（TBS）、血管抑素（angiostatin）、内皮抑素（endostatin）等，这些因子作为肿瘤血管基因治疗的靶分子受到人们的关注，有的已进入临床实验阶段。

BAI-1基因含有5个血小板凝血酶敏感蛋白1（TSP-1）重复序列，在体外可抑制由基底膜成纤维细胞生长因子（bFGF）诱发的血管新生，该基因至少有一个功能性的P53结合序列诱导P53活化，发挥抑癌基因的作用。

BAI-1在人脑、结肠、胃、肺以及胰腺等正常组织中均有表达，而在对应恶性肿瘤中，BAI-1含量会明显减少甚至不表达。本实验发现，BAI-1在人正常肾组织中高表达，而在肾细胞癌组织中表达会减少甚至缺如，并且其表达减少程度与肾细胞癌恶性程度具有一定相关性。肾细胞癌恶性程度越高，BAI-1表达越少，在T3-4期肾细胞癌中甚至可以看到BAI-1完全不表达。这一结果证实了之前的猜想，BAI-1可能是一种潜在的抑癌蛋白，通过其抗肿瘤血管增生来抑制恶性肿瘤的发生发展，这可能与BAI-1的TSR重复区有关，该区域具有抑制肿瘤血管的生成功能，去除BAI-1就相当于去除了肿瘤细胞内血管生成的阀门从而使肿瘤内血管生长加速。所以BAI-1的重新表达或者BAI-1的膜外片段成为治疗肿瘤的新的一个靶标蛋白。

血管内皮生长因子（VEGF）是一种分泌型糖蛋白，能够特异性促血管内皮细胞有丝分裂［11］。其表达是大多数恶性肿瘤细胞无限增殖的必要条件。VEGF的高表达与肿瘤患者的生存时间、早期复发、浸润及转移等有关［12-14］。MVD是衡量微血管形成的定量指标，是将肿瘤中的微血管通过特异性抗原如Ⅷ因子相关抗原、CD34、CD31或CD105染色以显示血管内皮细胞，然后在显微镜下计数微血管数量的一种方法，MVD可作为判断泌尿系肿瘤恶性程度、复发、转移、预后的重要指标。目前认为CD34是最敏感的内皮细胞标记物，而且CD34标记的MVD对预后的判断价值也最大。

本实验通过对正常肾组织及不同分级肾细胞癌组织的对比研究分析发现，BAI-1含量与VEGF、MVD是成反比的。同时根据对BAI-1结构的研究可以发现，BAI-1为跨膜蛋白，其胞膜外有2个功能区域，其中一个为血小板凝血酶敏感蛋白1（TSP1）重复区［15-16］。TSP1可以抑制由成纤维细胞生长因子（FGF）诱导的新生血管生成，而VEGF可以受FGF调控［15］，本实验结果也符合这一结果，BAI-1表达与VEGF、MVD呈负相关，从而证实了BAI-1在抑制肿瘤血管生长方面的作用。

BAI-1是在研究P53时被分离出来的，并且发现其受野生型P53表达调控，而在变异P53组织中无表达［17］，具体调控机制目前仍不清楚。本实验中免疫组化结果显示在肾细胞癌组织中P53含量明显减少，同时其减少程度与肾细胞癌恶性度成正相关。而这种相关关系与BAI-1在不同恶性度肾细胞癌中的表达相符合，因此本实验猜测BAI-1在肾细胞癌中表达减少可能与P53突变有关，并且依据其突变程度决定其减少程度。

BAI-1因其结构功能使其可能具有了抗肿瘤血管生长的作用，而且其作用机制、特性等至今仍不十分清楚，本实验通过对肾细胞癌组织进行免疫组化检测初步验证了BAI-1对VEGF、MVD之间关系，但尚需要进一步研究。对BAI-1抑制肿瘤新生血管生成全面了解，将为恶性肿瘤浸润转移的探索和治疗开辟新的道路。

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（2012-06-12收稿）（2013-02-01修回）

Expression of brain-specific angiogenesis inhibitor 1 and its correlation with VEGF,MVD,and P53 in renal cell carcinoma

Dawei TIAN,Yan SUN,Yuming YANG,Yang TANG,Mingde LEI,Ruifa HAN

Ruifa HAN;E-mail:jianshi001@126.com
Department Of Urology,Second Hospital Of Tianjin Medical University,Tianjin Institute Of Urology,Tianjin 300211,China

Objective:This study aims to compare the difference in the expression and localization of brain-specific angiogenesis inhibitor 1(bai-1)between human normal and clear cell carcinoma of kidney tissues at different clinical stages.this study also aims to explore the mechanism of bai-1-mediated inhibition of tumor endothelial cell proliferation.Methods:A total of 133 human normal and cancerous kidney tissues were obtained.the tissue localized more than 4 cm away from the cancerous kidney tissue was identified as the normal control kidney tissue.immunohistochemical staining was conducted to detect the expression of bai-1,vegf,mvd,and p53.the expression was detected with the respective antibodies for quantitative statistical analysis.fresh renal cell carcinoma tissue samples were obtained from 27 patients,and 15 tissue samples were obtained 4 cm away from the cancer.the expression of bai-1 in the renal cell carcinoma tissue was examined through western blot analysis.Results:The bai-1 expression level in the normal kidney tissues is much higher compared with that in the kidney cancer tissues,which ranged from low and moderate to high differentiated stages.statistical analysis results revealed a correlation between the expression of bai-1 and vegf,mvd,and p53 proteins.Conclusion:The expression level of bai-1 in kidney cancer tissues is very low,even difficult to detect,compared with the increased expression of vegf and cd34.this finding suggests that bai-1 can inhibit tumor angiogenesis.the level of p53 is positively correlated with the expression of bai-1 according to the data derived with the spearman software,suggesting the existence of crosstalk between these two molecules.

BAI-1,renal cell carcinoma,P53,VEGF,targeted therapy,MVD

10.3969/j.issn.1000-8179.2013.06.009

天津医科大学第二医院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津市南开医院（天津市300211）

韩瑞发 jianshi001@126.com

（本文编辑：郑莉）