婴幼儿杜氏型肌营养不良临床表现及其基因和骨骼肌病理特征

韩春锡 林婧娴 吴维青 陈盼盼 谢建生 廖建湘

杜氏型肌营养不良( DMD) 是以肌纤维变性、坏死、再生及间质结缔组织增生为主要病理特点，以进行性肌无力，肌肉萎缩为主要临床特征的X 连锁隐性遗传性疾病［1，2］。大量肌纤维的坏死，使肌纤维内的CK、AST 和ALT 释放到血液中，导致血清肌酶升高［3，4］。婴幼儿DMD 的运动发育尚未成熟，皮下脂肪丰富，缺乏肌无力、肌萎缩等典型临床表现，大多仅表现为血清CK、AST 或ALT 水平升高，往往被误诊为“心肌炎”或“肝炎”，实施不必要的辅助检查，包括创伤性肝穿刺等［5～9］，失去早期诊断、治疗和接受遗传咨询的良机［10，11］。本研究通过分析婴幼儿DMD 的临床表现、血生化、基因以及骨骼肌病理特征，为早期诊断婴幼儿DMD 提供依据。

1 方法

1.1 DMD 的诊断标准 目前尚缺乏婴幼儿DMD 的诊断标准，但鉴于DMD 基因突变检测可为临床诊断提供直接和可靠的依据［2，12］，DMD 骨骼肌病理改变是引起临床症状、体征的基础［2，13］。本研究中诊断婴幼儿DMD，至少满足以下2 项中任意1 项方可诊断：①DMD 基因发生移码突变，同时伴有运动发育迟缓、走路不稳和易摔倒等临床表现；②DMD 基因突变不伴有DMD 临床表现时，须通过肌活检证实dystrophin 完全缺失。

1.2 病例纳入标准 深圳市儿童医院( 我院) 从2009 年6月起对在神经肌肉病专科门诊就诊的患儿进行随访观察，故本研究纳入2009 年6 月至2013 年3 月在专科门诊首诊、未在外院接受过糖皮质激素治疗、通过DMD 基因检查和( 或) 肌活检确诊为DMD 的男性婴幼儿。

1.3 分组 为观察患儿运动发育与血清CK、AST、ALT 之间的关系，本研究依据患儿首诊年龄分为4 组：0 ～6、～12、～24 和～36 月龄组。

1.4 血清CK、AST 和ALT 检测 首诊时采集非抗凝静脉血2.0 mL，于我院常规检测CK、ALT 和AST 水平，正常值分别为：CK 25 ～175 U·L-1，AST 0 ～40 U·L-1，ALT 0 ～40 U·L-1。

1.5 肌电图及神经传导速度检查 使用Nicolet 肌电图仪( Viking ⅣP，美国) ，检测正中神经、尺神经、腓总神经的运动、感觉神经传导速度和肱二头肌、股内肌、腓肠肌的同心圆针EMG，包括安静状态下插入电位、自发电位，轻收缩时运动时限、波幅和多相波百分比以及重收缩时运动单位的募集相型和波幅。

1.6 DMD 基因检查［12，14］采集静脉血2.0 mL，EDTA 抗凝，磁珠吸附法提取基因组DNA( Lab-Aid 基因组DNA 分离试剂盒，厦门致善生物科技有限公司) ，MLPA 法( MLPA P034/P035 试剂盒，MRC-HOLLAND 公司) 检测DMD 基因79 个外显子的缺失或重复。对未发现外显子异常的患儿进行DMD 全基因测序，检测点突变。

1.7 肌肉活检［2，15］对非移码缺失突变、重复突变、点突变以及虽是移码缺失突变，但缺乏DMD 临床症状的患儿进行肌肉活检。在利多卡因局部麻醉下取左腓肠肌组织0.5 cm×0.5 cm ×0.6 cm，制成8 μm 厚冰冻切片，实施常规组织化学和组织酶学染色，采用抗dystrophin-C 末端、N-末端、中央棒状区的单克隆抗体1∶100 稀释( Novocastra 公司，美国) ，实施免疫组织化学染色。病理切片由我院神经肌肉病研究室2 名专业医生读片。

1.8 随访 根据患儿年龄，每3 个月至1 年来我院门诊随访，6 月龄起随访运动发育状况。

1.9 统计学方法 采用SPSS 16.0 软件进行统计学分析。计量资料采用x±s表示，组间比较采用方差分析，方差不齐时采用Wiilconxon Signed Ranks 检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 共纳入男性DMD 患儿43 例，其中门诊患儿17 例，住院患儿26 例。就诊年龄1 ～34( 18.2 ±11.3)月龄。0 ～6 月龄组7 例，～12 月龄组9 例，～24 月龄组8例，～36 月龄组19 例。

对36 例患儿进行了总体运动发育评估，其中31 例(86.1%) 出现运动发育延迟，平均(8.6 ±2.4) 个月时会独坐，(18.6 ±4.9) 个月时会独立行走。对24 例患儿进行了粗大和精细运动发育评估，其中20 例( 83.3%) 在运动发育过程中不会或不愿意爬行运动，行走时左右摇摆，呈鸭步，易跌倒；与同年龄幼儿相比，不能双脚蹦跳，扶着东西上楼梯，地上捡东西时不完全弯曲膝关节，单手或双手扶着膝盖缓慢站立。对19 例患儿进行了语言能力评估，其中5 例(26.3%) 表现为吐字不清。

2.2 就诊原因 43 例DMD 患儿中，因上呼吸道感染，查血清CK 和转氨酶水平升高就诊者分别有21 例( 48.8%)和13 例(30.2%) ，其中误诊为心肌炎14 例，原因不明的高CK 血症7 例；因入托体检时发现ALT 升高误诊为肝炎就诊13 例( 30. 2%) ； 因 单 纯 运 动 发 育 迟 缓 就 诊6 例(14.0%) ；有DMD 家族史并伴有运动障碍，高度怀疑DMD就诊3 例(7.0%) 。

2.3 肌力和肌容积的改变 4 个年龄组的上肢肌力及0 ～6、～12 月龄组患儿的下肢肌力均基本正常。～24 月龄组6/9 例和～36 月龄组所有患儿的下肢近端肌力均为Ⅴ-( 未能蹲起自如) 。～24 和～36 月龄组患儿均有股外侧肌和( 或) 腓肠肌的假性肥大及不同程度的肌肉硬度改变。所有年龄组患儿均未见明显肌萎缩。

2.4 血清CK、AST 和ALT 水平 首诊时43 例DMD 患儿血清CK、AST 和ALT 水平均明显高于正常值。～12、～24和～36 月龄组血清CK 和ALT 水平较0 ～6 月龄组升高( P分别为0.02、002 和0.001) ，～12、～24 和～36 月龄组间血清CK、AST 和ALT 水平差异均无统计学意义( 均P ＞0.05)( 表1) 。

2.5 DMD 基因检测 43 例DMD 患儿均采用MLPA 法检测DMD 基因79 个外显子的缺失或重复，其中移码缺失突变29 例(67.4%) ，非移码缺失突变2 例( 4.6%) ，单纯重复突变4 例(9.3%) ，重复和缺失同时存在1 例( 2.3%) 。7 例(16.3%) 未发现外显子缺失或重复，实施DMD 全基因测序，均发现有害点突变。

表1 婴幼儿DMD 患儿不同年龄组血清CK、AST、ALT 水平( U·L -1) 比较( x±s)Tab 1 Comparison of serum CK，AST，ALT activity( U·L -1) among different infant DMD groups( x±s)

2.6 肌肉活检 16 例进行肌肉活检。光镜下均可见大量萎缩、变性、坏死肌纤维及再生肌纤维( 图1A) ，间质脂肪结缔组织增生( 图1B) ，符合肌营养不良样病理改变，但很少见到特大的肥大肌纤维、断裂肌纤维以及环状改变的肌纤维。坏死肌纤维周围均可见不同程度的炎细胞浸润。16例患儿肌纤维膜上抗肌萎缩蛋白-C、N 单克隆抗体的免疫染色均表达缺失( 图1C ～E) ，偶见抗肌萎缩蛋白-R 示弱阳性。免疫染色阳性对照抗肌萎缩蛋白表达正常( 图1F) 。

2.7 肌电图及神经传导速度检查 12 例进行了肌电图检查，神经传导速度均正常，其中8 例表现为放松时未见失神经电位，轻收缩时运动单位平均时限变窄、波幅降低，强收缩时呈混合相，提示肌源性损害。

图1 DMD 患儿骨骼肌病理变化和抗肌萎缩蛋白免疫染色( ×200)Fig 1 Pathological changes of skeletal muscle and immunohistochemical staining with antibodies to dystrophin ( ×200)

3 讨论

DMD 患儿的骨骼肌损伤是由躯干和四肢近端开始缓慢发展，表现为进行性、对称性肌无力，肌萎缩伴腓肠肌的假性肥大，下肢受累重于上肢［1，2］。由于髂腰肌和下肢近端肌肉受累早且重，因此患儿由仰卧位站立时，用手支撑躯干呈俯跪位，接着以双手顺次支撑双足背、膝部等处，方能站立，即Gower 征阳性。然而，婴幼儿期DMD 患儿常缺乏典型的阳性Gower 征，仅表现为开始端坐、独站和行走的年龄延迟，行走时两侧摇摆，呈鸭步或行走易跌倒，或从地上捡东西时不全屈曲膝关节，仅用弯腰动作来完成。多数患儿不能或不愿意爬行，而这些临床表现均提示患儿的骨盆带肌和下肢近端肌肉受累，但常未能引起患儿家属或医生的重视，被误认为患儿的行为习惯异常或佝偻病的表现［5，9］。本研究发现，生后1 ～2 个月的DMD 婴儿虽然缺乏肌无力和肌萎缩表现，但在扶着患儿站立状态下可触及股外侧肌和腓肠肌的肌肉硬、韧，是早期诊断DMD 的重要体征，应引起临床医生的重视。如果婴儿早期出现肌无力、肌张力低下和肌萎缩等典型的神经肌肉病表现，则不应考虑DMD，而应考虑先天性肌病、先天性肌营养不良、糖原累积病以及脑和脊髓疾病引起的松软儿等［16］。

肌电图检查有助于鉴别肌源性损伤或神经源性损伤。但在婴儿DMD 的肌电图检查中，因患儿的运动单位电位幅度小，检查不配合，因此要单纯鉴别骨骼肌是否发生神经源性损害还是肌源性损害，肌电图的检查意义不如检测血清CK、AST 和ALT 水平，血清CK、AST 和ALT 成比例升高，直接提示骨骼肌发生肌源性损害，但心肌酶正常不能排除骨骼肌的肌源性损害。一般情况下，骨骼肌发生神经源性损害时，心肌酶正常或轻微升高。

本研究中，患儿就诊原因为CK 和AST、ALT 升高占79%。然而，冯善伟等［17］对436 例( 平均年龄为9.7 岁)DMD 患儿的临床研究结果表明，就诊主要原因为走路困难易摔倒(42%) 和上楼梯困难(38%) ，提示不同年龄段患儿的就诊原因各不相同，不明原因的血清CK、AST、ALT 升高是诊断婴幼儿DMD 的重要线索［18，19］。由于骨骼肌组织中均含有丰富的CK、AST 和ALT，因此当发生肌纤维组织损伤时血清CK、AST 和ALT 均明显升高，其中以CK 的变化最为敏感［20，21］。本研究结果显示，0 ～6 月龄组血清CK 水平超过正常值上限的50 倍以上，而～12 月龄组血清CK 水平可达正常值上限的140 倍。提示： ①DMD 婴儿早期，虽然尚未出现明显的肌无力、肌萎缩等表现，但患儿体内已开始发生肌纤维的大量破坏；②～12 月龄组血清CK 水平升高最显著，可能与患儿活动量增加有关，但可能还有其他因素参与肌纤维的损伤过程［20～24］，有必要进一步探讨； ③婴幼儿DMD 血清CK 水平虽然有波动，但始终维持在较高水平，表明患儿的肌纤维破坏有可能持续发生。

本研究患儿血清CK 水平的升高总是伴随着AST 和ALT 水平的升高，这种变化特点不同于骨骼肌外伤或其他组织细胞损伤，如肝炎、心肌炎等引起的血清酶改变。骨骼肌外伤或心肌炎引起的CK 升高，往往随着病因的消除，其CK 水平也逐渐恢复至正常，同时伴有相应疾病的症状和体征，如骨骼肌外伤史或心脏功能异常以及心电图的改变等。虽然，肝炎患儿也可出现AST 和ALT 升高，但一般不会伴有CK 的明显升高。因此，当发现男性婴幼儿出现原因不明的血清CK、AST 和ALT 伴随升高时，应注意肌营养不良的可能，即使是缺乏DMD 临床症状，也有必要进行DMD基因检测协助诊断［19］。由于DMD 外显子的缺失或重复只占DMD 基因突变的70%左右，因此高度怀疑DMD，但仍未发现外显子的缺失或重复时，应该实施DMD 全基因测序或肌活检。

当发生DMD 基因突变，但并不改变翻译阅读框架( 即非移码突变)［16］，则临床上并不表现为典型的DMD，而表现为症状较轻的贝克型肌营养不良( BMD) 。因此，一般情况下只要发生移码突变，不管是外显子的缺失、重复还是点突变，婴幼儿DMD 的临床表现都较类似，表现为运动发育延迟，走路不稳容易摔倒。但部分外显子的非移码突变可导致DMD，详细机制尚不清楚。肌活检是诊断和鉴别诊断肌病的重要手段，但肌活检不是诊断DMD 的绝对适应证［18］。如婴幼儿期已经出现DMD 的临床表现，同时检测到DMD 外显子缺失或重复，并通过DMD 结构与功能相关网站数据库( eDystrophin online database) 查找基因突变属于移码突变，就可确诊DMD［13］。本研究结果表明，DMD 婴幼儿骨骼肌中已经发生肌纤维的大量萎缩、变性、坏死、再生以及脂肪结缔组织增生等较典型肌营养不良的病理改变，提示早期干预婴幼儿DMD 的必要性。

[1]Bushby K, Finkel R, Birnkrant DJ, et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1：diagnosis, and pharmacological and psychosocial management.Lancet Neurol,2010,9(1)：77-93

[2]杉田秀夫,小泽瑛二郎,梦中征载. 新肌肉病学. 南江堂,东京： 1995.469-486

[3]McMillan HJ, Gregas M, Darras BT, et al. Serum transaminase levels in boys with Duchenne and Becker muscular dystrophy. Pediatrics,2011,127(1)：132-136

[4]Urganci N, Arapoqlu M, Serdaroqlu P, et al. Incidental raised transaminases： a clue to muscle disease. Ann Trop Paediatr,2006,26(4)：345-348

[5]Zamora S, Adams C, Butzner JD, et al. Elevated aminotransferases activity as an indication of muscular dystrophy： case reports and review of the literature. Can J Gastroenterol,1996,10(6)： 389-393

[6]Veropalumbo C, Del Giudice E, Esposito G, et al.Aminotransferases and muscular diseases： a disregarded lesson.Case reports and review of the literature. Paediatr Child Health,2012,48(10)：886-890

[7]Wright MA, Yang ML, Parsons JA, et al. Consider muscle disease in children with elevated transaminase. J Am Board Fam Med,2012,25(4)：536-540

[8]Liu P(刘平), Wu J, Hu WG, et al. Analysis of clinical characteristics of 5 children with progressive muscular dystrophy misdiagnosed as having virus hepatitis. Clinical Misdiagnosis ＆Mistherapy(临床误诊误治),2012,25(7)：40-42

[9]Zhao CT(赵春婷), Zhang QZ, Wang T. 肌营养不良误诊为心肌炎一例. New Medicine(新医学),2012,43(6)： 424-425

[10]Moat SJ, Bradley DM, Salmon R, et al. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy： 21 years experience in Wales (UK) . Eur J Hum Genet,2013. Epub ahead of print

[11]Iwańczak F, Stawarski A, Potyrala M,et al. Early symptoms of Duchenne muscular dystrophy--description of cases of an 18-month-old and an 8-year-old .patient. Med Sci Monit,2000,6(3)：592-595

[12]Nicolas A, Lucchetti-Miganeh C, Yaou RB, et al. Assessment of the structural and functional impact of in-frame mutations of the DMD gene, using the tools included in the eDystrophin online database. Orphanet J Rare Dis,2012,7：45

[13]王德新. 肌肉疾病. 神经病学. 北京：人民军医出版社,2007.214-228

[14]Witting N, Duno M, Vissing J. Becker muscular dystrophy with widespread muscle hypertrophy and a non-sense mutation of exon 2. Neuromuscul Disord,2013,23(1)：25-28

[15]Taylor LE, Kaminoh, YJ, Rodesch CK, et al. Flanigan.Quantification of dystrophin immunofluorescence in dystrophinopathy muscle specimens. Neuropathology and Applied Neurobiology 2012,38：591-601

[16]Singh SM, Mallela KM. The N-terminal actin-binding tandem calponin-homology (CH) domain of dystrophin is in a closed conformation in solution and when bound to F-actin . Biophys J,2012,103(9)：1970-1978

[17]Feng SW(冯善伟), Liang YY, Cao JQ, et al. Duchenne 型假肥大肌营养不良患儿的主要生活事件. J Appl Clin Pediatr(实用儿科临床杂志),2012,27(24)：1866-1868

[18]Han CX(韩春锡). Diagnostic approach and muscle biopsy of myopathies in children. J Appl Clin Pediatr(实用儿科临床杂志),2012,27(24)：1860-1863

[19]Chang XZ(常杏芝), Yuan Y, Qin J. Persistent hypertransaminasemia as the presenting finding of childhood occult muscle disease. Chinese Journal of Medicine(中国医刊),2006,41(4)：42-44

[20]Kohli R, Harris DC, Whitington PF. Relative elevations of serum alanine and aspartate aminotransferases in muscular dystrophy. J Pediatr Gastroenterol Nutr,2005,41(1)：121-124

[21]Zamora S, Adams C, Butzner JD, et al. Elevated aminotransferases activity as an indication of muscular dystrophy： case reports and review of the literature. Can J Gastroenterol,1996,10(6)： 389-393

[22]Lev EI, Tur-Kaspa I, Ashkenazy I, et al. Distribution of serum creatine kinase activity in young healthy persons. Clin Chem Acta,1999,279(1/2)：107-115

[23]Meltzer H. Factors affecting serum creatine phosphokinase levels in the general populations： the role of race, activity and sex. Clin Chim Acta,1971,33(1)：165-172

[24]Baird MF, Graham SM, Baker JS, et al. Creatine-kinase-and exercise-related muscle damage implications for muscle performance and recovery. J Nutr Metab,2012,2012：960363