古柏树新病原菌—拟黄薄孔菌分析鉴定

商圆圆，张恩奎，孙晓琳，霍存录，冯 望，吴 颖，贺新生

(1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010;2.金堂县林业局，四川 金堂 610400)

柏树(Cupressus funebris Endl.)为常绿乔木，属于柏科(Cupressaceae)，柏木属(Cupressus)［1］，有 22属约150种，中国有8属30种，是我国亚热带代表性针叶树种之一［2］。由于柏科植物对气候和土壤有很强的适应能力，自然分布广，树干直，适应性广，在山地绿化、防风固沙及水土保持等方面起着重要作用［3］，此外很多古柏树林，历经千年沧桑而仍完好茂盛，生机盎然，例如由近万株森森古柏组成的翠云廊，现在已经成了著名的风景旅游区［4］。这些千年古柏同样也面临着越来越多的病虫及病原真菌的威胁，现在非常有必要及时对这些柏树的威胁因素进行较为深刻的认识和研究［7］。

近年来，笔者在四川省剑阁县、江油市、梓潼县、都江堰市等地的汉代古柏树上发现了一种新的病原真菌，引起古柏树树根和树干褐腐病，最终导致树木枯死。该菌属于菌物界(Fungi)，担子菌门(Basidiomycota)，伞菌亚门 (Agaricomycotina)，伞菌纲(Agaricomycetes)，多孔菌目(Polyporales)，拟层孔菌科(Fomitopsidaceae)，薄孔菌属(Antrodia P.Karst)。在形态学分析的基础上，本文利用分子系统学方法对其构建同源树，以更加客观准确地判定其是否为一新种，也更加直观的分析拟黄薄孔菌的系统发育关系。由于拟黄薄孔菌对柏木有着很强的腐朽作用，所以对于古柏和木材质量的保护也要相应的提高，从而警惕类似病原真菌的侵入和防治。

1 材料与方法

1.1 试验材料

拟黄薄孔菌子实体，2010年5月3日由贺新生教授采集于四川省剑阁县翠云廊张飞井旁的柏树枯木上。标本保存在西南科技大学微生物实验室，编号为:164。

表1 供试菌株及其ITS序列登录号Table 1 The ITS accession number of test strains from GenBank

1.2 试验方法

1.2.1 形态学观察

首先对采集的子实体进行形态观察。组织分离得到纯菌种，挑取少量菌肉于PDA基础培养基上，在25℃进行活化培养，然后挑取部分菌丝接种于含有PDA基础培养基的培养皿上，25℃下培养，观察菌落形态。最后将菌丝置于光学显微镜下观察其菌丝的形态结构。

1.2.2 获得 ITS序列

首先，提取总脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)，采用十六烷基三甲基溴化铵法(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide，CTAB)，用 Lifefeng DNA纯化试剂盒进行纯化，1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。然后以总DNA为模板，ITS1和ITS4为引物进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)反应。采用 25 μL 的反应体系:2.5 μL 10×buffer，2.0 μL 4 种 dNTP 混合物，ITS1 和 ITS4引物各 2.0 μL，0.5 μL TagDNA 聚合酶，1.5 μL Mg2+，12.5 μL ddH2O，2.0 μL DNA 模板。反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性40 s，55℃退火50 s，72℃延伸50 s，72℃ 延伸10 min，循环35次，4℃保存。1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测产物。将理想的PCR产物寄送到生工生物工程(上海)有限公司进行测序，获得所需的ITS序列数据。

1.2.3 构建系统发育树

将已经获得的拟黄薄孔菌的ITS序列，在Gen-Bank通过NucleiBlast软件搜索出与之高相似的相关物种的ITS序列。然后利用DNAMAN(6.0.3.99版本)对所有的序列进行比对和构建同源树，确立拟黄薄孔菌的分类学地位和系统发育关系。最终确定其物种后，将拟黄薄孔菌的ITS序列上传到NCBI数据库，并获得序列号。

2 结果与分析

2.1 子实体和菌丝的形态特征

该菌春夏秋季发生在柏树树干枯朽部位、树干基部树皮，树根上，当年连续生长。如图1，担子果1 a生，平伏贴生，易与基质分离。新鲜时脆蜡质、软木质，干燥后变硬、脆，整体鲜黄色，易开裂成不规则的片状。菌管表面鲜黄色，干燥后变为黄白色、黄色，长3 mm～4 mm;菌管层黄色、黄白色，分层不明显，粉笔质，不易与菌肉分离，非放射状。孢子印白色。担孢子腊肠形、弯圆柱形，略弯曲，无色，薄壁，光滑，与Melzer和棉兰试剂均无变色反应，大小为2～3.5 ×0.8 ～1.0 μm。

图1 拟黄薄孔菌子实体形态Fig.1 The morphology of the fruiting bodies of Antrodia subxantha

菌丝系统3型，生殖菌丝，具锁状联合，薄壁，通常分枝，交织排列，直径2 μm ～2.5 μm;骨架菌丝占多数，厚壁，扭曲，常分枝，强烈交织排列，直径5 μm～6 μm，缠绕菌丝尖细，分枝发达，直径 0.5 μm ～1.5 μm。菌管菌丝与菌肉菌丝相似。

培养特征如图2，在琼脂培养基上菌丝先稀疏，呈白色、黄白色，后变密集、鲜黄色、黄色，菌丝具有爬壁性，可以直接形成子实体。菌丝具有明显的锁状联合。

图2 拟黄薄孔菌菌落及菌丝体形态Fig.2 The colony morphology and mycelium form of Antrodia subxantha

2.2 系统发育树分析

将拟黄薄孔菌的ITS序列(632bp)转化成Fast格式，并上传至GenBank，通过Blast比对，获得最大相似序列(表1)，并将已测序列上传至NCBI数据库，获得的序列号JN182921。然后结合已报道的拟黄薄孔菌的物种的ITS序列，利用ClustalX进行多重比对，最后用 DNAMAN(6.0.3.99 版本)软件对这12个供试菌株的ITS rDNA序列进行分析，得到系统发育树(图3)可看出，拟黄薄孔菌在分子系统的分析中属于薄孔菌属(Antrodia)，且较明显的区别于其它的菌株，单独聚类为一种。与已知的西加薄孔菌(Antrodia sitchensi)和黄薄孔菌(Antrodia xantha)的同源相似度为94%。

图3 基于拟黄薄孔菌的ITS同源性分析Fig.3 Phylogeny and relationships of Antrodia sp.based on ITS sequences

3 讨论

拟黄薄孔菌Antrodia subxantha Y.C.Dai＆ X.S.He.属于菌物界(Fungi)，担子菌门(Basidiomycota)，拟层孔菌科(Fomitopsidaceae)，薄孔菌属(Antrodia P.Karst)。在系统进化树中将12种薄孔菌物种聚为了四大类，其中拟黄薄孔菌以94%的相似度与细加薄孔菌 Antrodia sitchensis(Baxter)Gilb.＆Ryvarden聚类在一起，依据ITS序列的分类标准可判定二者为不同种。虽然在子实体形态上与黄薄孔菌Antrodia xantha(Fr.)Ryvarden和西加薄孔菌Antrodia sitchensis最相似，但该种子实体颜色更加鲜艳，为亮黄色，完全平伏贴生，没有发现形成层架状、蹄状的子实体。且显微观察发现该种孢子(大小为2～3.5 ×0.8 ～1.0 μm)明显小于黄色薄孔菌和西加薄孔菌，其中黄色薄孔菌孢子大小为4.2～5.0×1.2 μm，西加薄孔菌的孢子大小为4.5～5.5×1.8～ 2.2 μm［8～11］。

此外薄孔菌属中的大部分的物种的菌丝系统为二体型，分为生殖菌丝和骨架菌丝，而拟黄薄孔菌的菌丝为3型菌丝系统，具有生殖菌丝，菌管菌丝和菌肉菌丝，其中骨架菌丝与菌肉菌丝相似。拟黄薄孔菌在江油市六合乡、梓潼县七曲山大庙，成都青城山、绵阳江油市和梓潼县的古柏树上也均发现有存在，树龄超过1500 a～2000 a，一般生长在柏树树枝、树根、树皮还有枯树桩上，对于柏木的腐蚀能力强，在树根和树干表面引起褐色腐朽，最后导致全株植物枯死。可见其对于柏树生长和木材质量的影响比较广泛的，所以今后要加强对该种菌生长条件观察和防治方法的研究，为古柏名木的保护提供必要的科学依据。

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