生产用菌种筛选过程中西林控制的研究

(广东溢多利生物科技股份有限公司科研中心, 广东 珠海 519060)

谷氨酸发酵生产的水平首先取决于生产用菌种的性能。菌种在使用和保藏过程中会出现衰退现象，要稳定并提高发酵水平，必须定期对菌种进行分纯筛选，淘汰衰退的菌株，筛选出高产稳定的优良菌株供生产上使用。我厂是以甘蔗糖蜜为原料，采用在发酵对数生长期添加青霉素，然后再添加表面活性剂的发酵工艺。为了更好的服务于生产，根据实际操作情况，使得菌种筛选也尽量与生产发酵工艺相统一。

1 实验目的

1.1 根据生产用菌种的性能，摸索出一套合适的菌种筛选方法。

1.2 确定摇瓶筛选生产用菌种过程中西林的最佳控制时间和浓度。

2 实验原理

在发酵对数生长期早期添加青霉素能抑制菌体细胞壁的合成，形成不完全的细胞壁，进而导致形成不完全的细胞膜，除去阻碍谷氨酸向外渗透的障碍物，使得谷氨酸得以大量地积累。

作用机制：添加青霉素是抑制谷氨酸生产菌细胞壁的后期合成，主要是抑制糖肽转肽酶影响细胞壁肽聚糖的生物合成。因为青霉素的结构和革兰氏阳性的谷氨酸菌所特有的糖肽的D-Ala-D-Ala 末端结构类似，因而它取代合成糖肽的底物而和酶的活性中心结合，使五肽末端的丙氨酸不能被转肽酶移去，甘氨酸桥-头无法与它前面一个丙氨酸相接，因此交联不能形成，网状结构连接不起来，糖肽合成就不能完成，于是菌体内尿二磷和N-乙酰胞壁酸大量堆积，青霉素与转肽酶相结合，形成了青霉素的酶。结果形成不完全的细胞壁，导致形成不完全的细胞的渗透压差，进而导致细胞膜的物理损伤，形成不完全的细胞膜，失去渗透障碍物，增大了谷氨酸向胞外分泌的渗透能力。

3 实验器材

3.1 实验仪器

722可见光电子分光光度计、雷磁酸度计、离心机、SBA-40C生物传感分析仪旋转式摇床、超净工作台等。

3.2 实验材料

种子培养基：糖份6%、KH2PO40.2%、尿素1.4%。

发酵培养基：糖份 15%、H3PO40.1%、消泡油适量。

40%尿素溶液、42%流加糖、1/万青霉素钾溶液。

4 实验方法

4.1 种子培养

在超净工作台上无菌操作，从谷氨酸菌斜面挑取适量菌种接入装有250ml种子培养基的2L 摇瓶中，双层纱布封口。置于旋转式摇床上（850r/min），32℃振荡培养12小时后进行OD 、PH、CV值测定。

4.2 发酵培养

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取上述种液3ml 接入装有20ml 发酵培养基的250ml摇瓶中，加入40%尿素溶液0.6ml，双层纱布封口，置于旋转式摇床上（850r/min），32℃振荡培养至指定时期加入1/万浓度青霉素钾溶液。加完青霉素钾溶液后，改双层纱布为单层封口，调摇床转速为1000 r/min 振荡培养。发酵过程中根据需要流加适量尿素和流加糖。发酵32小时后，对发酵液进行OD 、PH、GA值测定。

4.3 分析方法

OD值测定：吸取样品液，用蒸馏水稀释50 倍，以蒸馏水作为空白对照，采用722可见光电子分光光度计于1cm 光程在波长696 nm 处测定。

CV值测定：吸取样品液10 ml，采用离心机以3500 r/min 的速度离心10分钟。

PH值测定：采用雷磁酸度计直接测定。

GA值测定：吸取样品液，用蒸馏水稀释100倍，采用SBA-40C 生物传感分析仪测定。

5 结果与分析

本实验中设计青霉素加入的指定时期分为6种不同的OD值阶段，加入青霉素的浓度分为4种浓度。共做3批摇瓶发酵试验，同一时期同一浓度每批3 瓶。表一为不同时期不同浓度青霉素添加的摇瓶发酵实验GA分析结果。从表一中可以看出，在OD值为0.38-0.42这个阶段加入1/万青霉素溶液0.7 ml的效果最好。

总之，在生长的某阶段添加青霉素是影响产量的关键因素，加的太早会抑制菌体生长，不能获得足够的菌体量；加的太迟菌体已经充分增殖，形成完整的细胞壁，青霉素不起作用。因此必须在增殖过程的适当时期添加，并且必须在添加后再进行一定的增殖。新增殖的细胞没有充足的细胞壁合成，菌体形态急剧变化，多呈现伸长、膨润的菌型，完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变。

[1]肖冬光.微生物工程原理.北京：中国轻工业出版社，2004.

[2]于信令.味精工业手册.北京：中国轻工业出版社，2009.