牛血液前处理方式对ELISA法检测克仑特罗结果的影响

闵成军，朱志盈，李小勇，金玉胜，武花锋，文美英

(江苏雨润肉类产业集团有限公司，江苏南京210041)

克仑特罗，异名克喘素、氨哮素，俗名“瘦肉精”，化学名为α-［(叔丁胺基)甲基］-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐［1-2］。克仑特罗属于β-兴奋剂类药物，在人医和兽医上用来治疗哮喘。20世纪80年代初，美国Cyanamid公司意外发现将高于治疗剂量5～10倍(即＞1g/kg·d)的克仑特罗添加于饲料饲喂动物后可明显促进动物生长、改善胴体品质、提高瘦肉率，克仑特罗作为一种非法饲料添加剂被许多专业饲养户和饲料加工企业所使用，已经成为了重大的食品安全问题［3-4］。90年代初期以来，出现多起克仑特罗中毒事件，并出现了死亡案例，因此被世界禁止使用。然而由于经济利益驱使，国内许多不法养殖场仍非法使用。目前分析检测克仑特罗的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、酶联免疫吸附检测方法(ELISA)和免疫胶体金检测方法［5-8］。经典的色谱法已不能满足大量检测任务的需要，因此ELISA快速检测试剂盒由于其方便、快速和灵敏检测而被广泛应用。国内有关克仑特罗检测的报道主要集中在生猪尿样、肝脏、肌肉组织［9-10］，而未见ELISA法检测牛血液样品的前处理的报道。在规模化的活牛屠宰场，ELISA方法是较为理想的牛血液克仑特罗残留筛选性分析方法之一，但是牛血液样品放置时间过长、血样品溶血、血样品被细菌污染、补体、胆红素等，均可导致假阳性结果的出现，而血清样品储存过久可能导致假阴性结果的出现，因此，牛血液样品前处理质量是保证检验结果可靠性的重要环节。本工作采用单因素实验和正交实验方法对牛血液样品的前处理条件进行优化，采用ELISA方法进行克仑特罗残留的筛选，采用LC-MS/MS法对筛选出的牛血液阳性样品进行确证实验，为规模化活牛屠宰厂控制克仑特罗假阳性结果提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验用牛血液样品 实验前即时采取;克仑特罗标准品 纯度99%以上，美国Sigma公司;克仑特罗酶联免疫检测试剂盒 杭州迪恩科技有限公司;抗凝剂 0.48g柠檬酸，1.37g柠檬酸钠，1.48g葡萄糖用60mL纯水溶解后，定容至100mL，4℃保存;甲醇、甲酸 色谱纯;β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶 美国Sigma公司;乙酸铵、氢氧化钠、异丙醇、乙酸乙酯和氨水 分析纯，北京化学试剂公司。

FA2004V电子天平 上海精密科学仪器有限公司;Thermo微量移液器 赛默飞世尔(上海)仪器有限公司;TDZ5-WS台式低速自动平衡离心机 长沙湘仪离心机有限公司;Model680酶标仪 美国;KS康氏振荡器 金坛市富华仪器有限公司;TQU02361 LC-MS/MS液相色谱-串联质谱仪 美国Thermo公司;RE-52AA旋转蒸发仪 上海荣华生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验

1.2.1.1 血样离心前放置时间对检测结果的影响采集5头牛静脉血，每头牛静脉血12管，每管5mL，分别记录采血时间并编号，血液样品中未添加抗凝剂。取同一样品的其中6管血样于室温分别放置0、30、60、90、120、150min 后，3000r/min 离心 10min 后即刻检测每份样品中克仑特罗的残留量。取另外6管血样于室温分别放置 0、30、60、90、120、150min 后，存放于4℃冰箱保存过夜，次日将血样从冰箱中取出，3000r/min离心10min，待血清样品恢复至室温时开始检测每份样品中克仑特罗的残留量。

1.2.1.2 血样离心后放置时间对检测结果的影响采集5头牛静脉血，每头牛静脉血3管，每管5mL，分别记录采血时间并编号，血液样品中未添加抗凝剂。将血样于室温放置30min后，3000r/min离心10min待测。分别测定相应血样离心后放置时间0、30、60、90、120、180min、4℃ 冰箱过夜保存后的每份样品中克仑特罗的残留量。

1.2.1.3 血样中抗凝剂添加比例对检测结果的影响采集5头牛静脉血，每头牛静脉血6管，抗凝剂与血液的比例分别为:不加抗凝剂、1∶9、1∶8、1∶6、1∶4、1∶3，分别记录采血时间并编号。血样于室温(20～25℃)放置 30min后，3000r/min离心 10min。取离心后同一样品的血清即刻检测克仑特罗的残留量，检测后余下的血清加盖于4℃冰箱保存过夜，次日将血清从冰箱中取出，待恢复室温后分别检测每份血清样品中克仑特罗的残留量。

1.2.2 正交实验 以血液离心前放置时间、离心后放置时间、抗凝剂添加比例3个因素按L9(34)正交表进行3因素3水平正交实验。正交实验因素水平设计见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal array design

1.2.3 ELISA法检测

1.2.3.1 ELISA检测步骤 将所需试剂从冷藏环境中取出。置于室温(20～25℃)平衡60min左右，将酶标物(冻干粉)、样品稀释液(5×)、清洗液(10×)配制成工作液，预先进行编号，标记标准品和样品的位置，从板上取下所需数量的微孔，在各标准孔中加入50μL的标准品溶液，在各样品孔中加入50μL样品溶液，立即在所有孔中加入100μL的酶标物，轻轻晃动反应板几秒钟，室温下(20～25℃)温浴10min;倒掉微孔中的液体，在所有微孔中加满清洗液250～300μL，洗板3次，在吸水纸上拍打，彻底清除微孔中的残留液和气泡;清洗程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中加入100μL显色剂，室温下(20～25℃)显色10min;每孔中加入100μL终止液，混匀在450nm下检测吸光度，10min内读取。

1.2.3.2 ELISA结果计算 分别检测每个标准品和样品的平均吸光度，所有标准品和样品的平均吸光度B除以空白标准品的平均吸光度B0即B/B0，将每个标准品的B/B0值输入试剂盒自带的半对数系统处理软件中，对应于各自的克仑特罗标准品的浓度可以获得一个标准曲线(B/B0为纵坐标，标准品的质量浓度为横坐标)，将样品的B/B0值输入试剂盒自带的半对数系统处理软件中即可得出在标准曲线上对应的克仑特罗浓度，乘以对应的样品稀释倍数，即为样品中克仑特罗实际残留量。

1.2.4 LC-MS/MS液相色谱-串联质谱法确证实验液相色谱-串联质谱检测方法具有干扰小、除去杂质能力较高、灵敏度低、可靠性高的优点。因此选用液相色谱-串联质谱检测方法作为检测克仑特罗的确证方法［11］。按照正交实验优化的方法处理牛血液样品，先用 ELISA法进行筛选，然后通过液相色谱-串联质谱法进行测定。

1.2.4.1 液相色谱条件 色谱柱:RIDA C18柱(150mm×2.1mm，5μm)，柱温为 30℃;流动相 A 相为0.1%甲酸甲醇溶液、B相为0.1%甲酸水溶液;流速:0.30mL/min;进样量:20μL。

1.2.4.2 质谱条件 电离方式:ESI+;电离电压:3.5kV;锥孔电压:25V;离子源温度:115℃;锥孔气流速:50L/h;雾化温度:320℃;雾化气流速:750L/h;检测方式为多反应监测(MRM)。

1.2.4.3 结果计算 以克仑特罗标准品的峰面积Y为纵坐标，以克仑特罗标准品质量浓度为X轴，分别测定质量浓度为 0.0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/L 的克仑特罗标准品溶液的响应值，绘制标准曲线，得到标准曲线方程。将样品的响应值代入标准曲线方程中，从标准曲线方程计算出样品对应的克仑特罗质量浓度，即为样品中克仑特罗实际残留量。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 血样离心前放置时间对检测结果的影响 由图1可见，当血样放置30min离心按照ELISA方法进行检测，血样中克仑特罗残留浓度最低，血样放置60、90、120、150min 离心进行检测，检测结果差异不显著(p＞0.10)。血液放置未过夜条件下，与60、90、120min离心检测的结果相比，放置150min离心检测结果呈现下降趋势。血液样品放置4℃过夜后再离心，得到的血清样品透明清澈，检测结果差异不显著(p＞0.10)，与离心前放置30min后检测的结果基本保持一致，从图中的变化趋势可见血液样品离心前放置时间对检测结果有一定影响。

图1 血液离心前放置时间对检测结果的影响Fig.1 Effect of standing time of blood sample before centrifugation on test results

在规模化活牛屠宰生产实践中采集到血液样品不可能立即进行离心检测，采集后的血液经放置一段时间离心有利于提高血清样品的质量，血液未开始凝固或凝固不完全时就强行离心，此时分离的血清中仍残留部分纤维蛋白原，进行ELISA检测时，容易造成假阳性结果，所以为确保检测结果的准确性，血液样品采集后应放置适当的时间后再进行离心。如果离心后的血清样品出现溶血现象，红细胞溶解时会释放出具有类过氧化物酶活性的物质，其作用与辣根过氧化物酶类似，如果反应孔非特异吸附类过氧化物酶活性的物质，则可催化底物显色加深，容易造成假阳性［12］。溶血现象在超微量、高精度检测分析中显然不可忽视，因此，控制样品离心前放置时间，减少溶血是保证检验质量的重要因素。龙宪和等［13］研究发现，无论在健康人还是乙型肝炎病毒感染者中，溶血均导致ELISA一步法检测HBsA假阳性结果的出现。本实验所采用的检测试剂盒为一步法检测，如果处理不当很可能会出现溶血样品检测假阳性的结果。

2.1.2 血样离心后放置时间对检测结果的影响 由图2可见，随着血清样品放置时间的延长，60、90、120min时检测结果呈上升趋势，120min时检测结果最高，随后检测结果呈现下降趋势，血样离心后即刻检测、离心后放置60min、离心后放置150min及4℃过夜保存，克仑特罗检测结果差异不显著(p＞0.10)。

图2 血液离心后放置时间对检测结果的影响Fig.2 Effect of standing time of blood sample after centrifugation on test results

2.1.3 血样中抗凝剂添加比例对检测结果的影响由图3可见，随着血液样品中抗凝剂添加比例的增加，检测结果呈现下降趋势。血液离心后直接检测和离心后放置4℃冰箱过夜保存后检测，检测结果变化不明显，只是抗凝剂添加比例1∶9时检测结果有差异，即4℃冰箱过夜保存比离心后直接检测结果偏低。添加抗凝剂离心分离的血清均比未添加抗凝剂分离的血清清澈透明，血液样品中添加抗凝剂，有利于提高离心后血清质量，从而保证检测结果的准确。

图3 血液中抗凝剂添加比例对检测结果的影响Fig.3 Effect of proportion of added anticoagulants in blood on test results

2.2 正交实验

2.2.2 直观分析和方差分析 从表2、表3的直观分析可知，各因素的最好水平为A2B1C2;比较各因素的极差可以看出，各因素对克仑特罗残留检测结果的影响，依程度排序为A＞C＞B。A之所以影响最大，很可能是因为血液放置不同时间后离心得到的血清质量不同所致。

通过表 4 方差分析可知，FA＞F0.95(2，2)=19.0，FC＞ F0.90(2，2)=9.0，FB＜ F0.90(2，2)=9.0，说明 A、C 两因素分别在显著水平0.05、0.10上差异显著，B因素差异不显著，与直观分析的结果一致。因此提高克仑特罗残留检测结果准确性的最佳血液样品前处理条件是A2B1C2，即离心前放置30min、离心后放置时间0min、抗凝剂添加比例为 1∶9。

表2 正交实验结果Table 2 Orthogonal array design experiment results

表3 正交实验结果直观分析Table 3 Intuitive analysis for Clenbuterol residues with various factors

表4 正交实验结果方差分析Table 4 Variance analysis for Clenbuterol residues with various factors

2.3 确证实验

采用ELISA法按照优化的血液样品前处理条件对30份牛血液样品进行检测，并用LC-MS/MS液相色谱-串联质谱法对阳性样品进行确证实验。

分别配制质量浓度2.0、4.0μg/L的标准品溶液，在全扫描方式下进样，调节电离源各个参数得到较强的［M+H］峰。在该条件下，对确定的母离子m/z277.100行子离子扫描，优化碰撞能量等参数，确定定量离子m/z 203.001，克仑特罗的离子流色谱图，见图4。

2.3.1 ELISA法检测灵敏度 同时测定50份空白牛血清样品的吸光度，按照1.2.3.2得出对应于吸光度的血清样品的浓度。检测限y=¯x+3s(¯x为50份空白样品浓度的平均值，s为50份空白样品浓度的标准差)，ELISA法检测牛血清样品的检测限为0.081μg/L，ELISA 试剂盒在 0.1～8.1μg/L 范围内呈线性关系。

2.3.2 LC-MS/MS 标准曲线 取 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/L的克仑特罗标准溶液，经LC-MS/MS分析，绘制标准曲线。结果表明克仑特罗在0.25～4.0μg/L范围内具有良好的线性关系，当以克仑特罗的峰面积和克仑特罗质量浓度进行线性回归，得到克仑特罗线性方程为y=60923.8x+1800.03，相关系数R2=0.9981。

图4 克仑特罗标准品的色谱图Fig.4 Chromatogram of 2、4μg/L standard clenbuterol

图5 克仑特罗标准曲线Fig.5 Standard curves of Clenbuterol

2.3.3 样品的分析检测结果 采用ELISA法按照优化的血液样品前处理条件对30份牛血液样品中克仑特仑残留进行检测，筛选出2份阳性样品(结果超过1.0μg/L)，结合 ELISA 试剂盒在 0.1～8.1μg/L 范围内呈线性关系，确定在1.0～8.1μg/L线性范围内，ELISA检测结果呈阳性。用LC-MS/MS液相色谱-串联质谱法对阳性样品进行确证实验，确证实验结果表明在1.0～8.1μg/L线性范围内，ELISA法检测结果假阳性率为0%。结果见表5，阳性样品的LC-MS/MS测定的质量色谱图如图6所示。

表5 样品的ELISA法和LC-MS/MS法检测结果比较(μg/L)Table 5 Comparison of clenbuterol residues in positive samples determined by ELISA and LC-MS/MS(μg/L)

3 结论

通过控制血液离心前放置时间、离心后放置时间、抗凝剂添加比例，可以有效提高血清样品的质量，最大程度的减少ELISA法检测牛血液样品中克仑特罗残留量假阳性的结果。分析前牛血液样品处理的各因素对克仑特罗残留检测结果的影响程度为:离心前放置时间＞抗凝剂添加比例＞离心后放置时间，牛血液样品最佳前处理条件为离心前放置30min、抗凝剂添加比例为 1∶9、离心后放置时间0min。

图6 克仑特罗阳性样品的色谱图Fig.6 Chromatogram of positive clenbuterol samples

按照牛血液样品最佳前处理条件，用ELISA法检测30份样品和用LC-MS/MS确证实验得出:在1.0～8.1μg/L线性范围内，ELISA法检测结果假阳性率为0%。

［1］许春光，杨克军.酶联免疫检测技术在生猪盐酸克仑特罗检测中的应用［J］.现代仪器，2005，11(6):46-47.

［2］张清安，范学辉.动物性食品中残留盐酸克仑特罗的研究进展［J］.食品科学，2005，26(4):265-268.

［3］Aldo Roda，Anna Chiara Manetta，Francesco Piazza，et al.A rapid and sensitive 384 - microtiter wells formats chemiluminescent enzyme immunoassay for clenbuterol［J］.Talanta，2000，52:311-318.

［4］Elliott C T，Mccaughey W J，Crooks SRH，et al.Residues of clenbuterol in cattle receiving therapeutic doses:Implications for differentiating between legal andillegaluse［J］.VetQ，1995，17:100-102.

［5］Fesser A C，Dickson L C，Macneil J D，et al.Determination of beta-agonists in liver and retina by liquid chromatographytandem mass spectrometry［J］.J AOAC Int，2005，88(1):61-69.

［6］Mulder P P，Zuidemat，Keestrang，et al.Determination of nifursol metabolites in poultry muscle and liver tissue development and validation of a confirmatory method［J］.Analyst，2005，130(5):763-771.

［7］Doerge D R，Churchwell M I，Holder C L，et al.Detection and confirmation of β-agonists in bovine retina using LC/APCI-MS［J］.Anal Chem，1996，68(11):1918-1923.

［8］杨成对，宋莉晖.克仑特罗残留的分析方法研究［J］.食品科学，2005，26(1):187-190.

［9］杨艳艳，王选年，魏红，等.猪尿液中盐酸克仑特罗残留的ELISA 法和 GC-MS法检测［J］.中国兽医杂志，2004，40(10):9-11

［10］张雪竹，甘一如，赵福年.液相色谱电化学法检测猪肉及肝中残留的盐酸克仑特罗［J］.药学学报，2004，39(4):276-280.

［11］成亚宁.生猪屠宰过程中盐酸克仑特罗检测方法研究［D］.杨凌:西北农林科技大学，2007.

［12］周红妹，黄小虎.ELISA法检测 HBsAg影响因素分析［J］.中国热带医学，2006，6(10):1867.

［13］龙宪和，童华诚.溶血对乙型肝炎五项血清标志物检测结果的影响［J］.中华医学检验杂志，1996，19(1):47-48.