缬沙坦对尿酸性肾病大鼠肾间质纤维化的干预机制研究

孔翠文，闫 慧，李 靖，杨 堃，王 艳

尿酸性肾病是因血尿酸升高，尿酸盐晶体在肾脏沉积引起的病变，可导致肾小管间质纤维化。研究表明，慢性缺氧是导致肾间质纤维化的重要因素［1］，目前尿酸性肾病大鼠是否存在缺氧状态及缬沙坦对其缺氧状态的影响少有报道。缺氧诱导因子－1α (hypoxia－inducible factor－1α，HIF－1α) 是组织缺氧时重要核转录因子，是缺氧的可靠标记物［2］。肾脏缺氧的基础是肾小管周围毛细血管 (peritubular capillaries，PTC)进行性减少［3］，而血小板反应蛋白 －1(thrombospondin－1，TSP－1)是强烈的抑制血管生成因子［4］。本研究通过酵母和腺嘌呤建立尿酸性肾病大鼠模型，观察肾脏TSP－1、HIF－1α的动态表达，探讨其是否存在缺氧机制及缬沙坦可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

1.1.1 实验动物 雄性健康Wistar大鼠 (购于山东鲁抗实验动物中心)36只，体质量 (190±10)g，饲养于青岛大学医学院附属医院SPF级动物实验房。

1.1.2 试剂 缬沙坦 (北京诺华制药有限公司)，Trizol试剂、逆转录聚合酶链反应 (RT－PCR)试剂盒、Premix Ex Taq(大连宝生物工程有限公司)，兔抗大鼠HIF－1α、TSP－1多克隆抗体及DAB显色试剂、Masson三色染色试剂盒 (福州迈新)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型 36只大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为正常组、模型组和缬沙坦组，每组12只。用10%酵母饲料喂养和腺嘌呤100 mg·kg－1·d－1灌胃造模。缬沙坦组在造模同时加用缬沙坦30 mg·kg－1·d－1灌胃治疗。正常组用普通饲料喂养，用与缬沙坦组等容积的蒸馏水灌胃。

1.2.2 标本收集与检测 3组大鼠均在入组后第3周、5周时于代谢笼中留取24 h尿液，每组处死6只大鼠，内眦静脉采血，摘取肾脏，称重后纵切，一份固定于4%多聚甲醛溶液，常规石蜡包埋;另一份放入液氮中用于RT－PCR。全自动生化分析仪检测血尿酸 (UA)、血肌酐 (Scr)。

1.2.3 肾组织病理 石蜡切片行常规苏木素－伊红染色法(HE)和Masson染色，于高倍镜下，每张切片随机采集10个肾皮质区域互不重叠的视野 (均不含肾小球和较大小动脉)，应用JD801形态学图像分析系统Version 1.0分析，肾间质纤维化相对面积=肾间质阳性染色面积/肾小管间质总面积 (肾小管管腔除外) ×100%，并取平均值。

1.2.4 肾组织TSP－1 mRNA和HIF－1α mRNA水平检测 根据Trizol说明书提取肾脏总RNA，并依据逆转录试剂盒说明合成cDNA。取 1 μl cDNA为模板进行 PCR扩增 (终体系20 μl)。引物序列及产物长度见表1。反应条件:预变性，95℃ 5 min，1个循环;PCR反应，98℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，40个循环，72℃终延伸10 min。PCR产物定量:产物用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化已锭染色，凝胶成像系统扫描DNA条带，并应用Quantity One 4.6软件分析灰度值。各组基因相对表达量以目的基因/β－actin的灰度比值来表示。

表1 RT－PCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT－PCR

1.2.5 肾脏免疫组织化学法检查 常规脱蜡，SP法检测肾组织TSP－1、HIF－1α表达，具体步骤按试剂盒说明书进行，以肾实质及间质细胞出现棕褐色颗粒为阳性着色，采集及分析切片图像信息，方法同Masson染色，肾小管间质相对阳性面积=肾小管间质阳性染色面积/肾小管间质总面积 (去除肾小管管腔) ×100%。

1.3 统计学方法 应用SPSS 18.0统计软件进行分析。计量资料数据以 (±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用SNK法检验;两指标间的相关性采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠的体质量及血生化指标水平 3组大鼠3周和5周时测得的体质量、UA、Scr水平比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。模型组和缬沙坦组与对照组比较，大鼠3周、5周时的体质量、UA、Scr水平间差异均有统计学意义 (P＜0.05);缬沙坦组与模型组比较，大鼠3周和5周时的体质量、Scr水平间差异均有统计学意义 (P＜0.01，见表2)。

2.2 肾脏病理学

2.2.1 病理改变 正常组大鼠肾脏基本正常，HE染色、Masson染色显示胶原主要位于肾小管基底膜、Bowman囊等处(见图1A、图2A)。(2)模型组大鼠3周时肾小球轻度肿大，肾小管上皮细胞轻度萎缩并有空泡变性，间质可见大量单核细胞、淋巴细胞浸润，可见蓝染的胶原纤维;5周时可见尿酸盐晶体，肾小管上皮萎缩，蓝染胶原纤维明显增多 (见图1B、图2B)。(3)与模型组相比，缬沙坦组肾脏尿酸盐晶体明显减少，纤维化程度减轻 (见图1C、图2C、表3)。

2.2.2 免疫组织化学 3组大鼠3周和5周时测得的肾脏HIF－1α、TSP－1表达量间差异均有统计学意义 (P＜0.05)。模型组、缬沙坦组的表达量均高于正常组，模型组的表达量亦高于缬沙坦组，差异均有统计学意义 (P＜0.05，见表3)。正常组肾脏HIF－1α仅在皮髓质交界处肾小管上皮细胞散在表达;模型组和缬沙坦组HIF－1α的表达量增加，主要位于肾小管上皮细胞和间质成纤维细胞、炎细胞的胞核和胞质 (见图3)。正常组肾脏TSP－1仅少量表达于肾小球壁层和肾间质。模型组和缬沙坦组TSP－1的表达量增加，广泛表达于肾小管上皮细胞的胞质 (见图4)。

2.3 RT－PCR结果 3组大鼠3周和5周时RT－PCR测得的TSP－1 mRNA、HIF－1α mRNA表达量比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05)。模型组和缬沙坦组3周和5周时TSP－1 mRNA、HIF－1α mRNA的表达量均高于正常组，模型组3周和5周时TSP－1 mRNA、HIF－1α mRNA的表达量亦均高于缬沙坦组，差异均有统计学意义 (P＜0.05，见图5、图6)。

图1 5周后3组大鼠HE染色结果 (×200)Figure 1 HE staining of three groups at 5 week

图2 5周后3组大鼠Masson染色结果 (×400)Figure 2 Masson staining of three groups at 5 week

图3 5周后3组大鼠HIF－1α免疫组织化学结果 (×400)Figure 3 HIF－1α expression by immunohistochemistry of three groups at 5 week

图4 5周后3组大鼠TSP－1免疫组织化学结果 (×400)Figure 4 TSP－1 expression by immunohistochemistry of three groups at 5 week

2.4 相关性分析 模型组大鼠3周和5周时肾组织TSP－1 mRNA与HIF－1α mRNA的表达分别呈正相关 (r值分别为0.821和0.736，P＜0.05)。

表2 3组大鼠的体质量及血生化指标水平比较 (±s)Table 2 Comparison of body mass and biochemical indexes of rats in three groups

表2 3组大鼠的体质量及血生化指标水平比较 (±s)Table 2 Comparison of body mass and biochemical indexes of rats in three groups

注:UA=血尿酸，Scr=血肌酐;与正常组比较，△P＜0.05;与模型组比较，▲P＜0.05

组别 只数 体质量(g)3周 5周UA(μmol/L)3周 5周Scr(μmol/L)3周 5周正常组 12 332±16 428±24 81±10 78±13 26± 7 28± 8模型组 12 288±24△ 242±37△ 135±32△ 124±14△ 112±27△ 177±23△缬沙坦组 12 301±25△▲ 345±29△▲ 133±19△ 127±18△ 82±15△▲ 138±21△▲F 值＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 383.60 160.01 41.22 136.50 214.58 172.98 P值

表3 3组大鼠Masson染色面积比及HIF－1α和TSP－1表达比较 (x ± s，%)Table 3 Comparison of Masson staining and expression of HIF－1α，TSP－1 in three groups

图5 3组大鼠TSP－1 mRNA相对表达量Figure 5 Comparison of levels of TSP－1 mRNA of rats in three groups

图6 3组大鼠HIF－1α mRNA相对表达量Figure 6 Comparison of levels of HIF－1α mRNA of rats in three groups

3 讨论

肾间质纤维化是各种肾脏疾病进行性发展的共同转归，尿酸性肾病也不除外。肾间质纤维化机制目前认为是多种细胞因子参与的复杂过程。近年来PTC丢失及组织缺氧在肾间质纤维化中的作用日益引起人们的重视。研究表明，以小管间质病变为主的肾脏疾病由于水肿、炎症等会直接影响血流和氧的供应［5－6］。HIF－1是由 HIF－1α 和 HIF －1β 组成的异二聚体复合物，HIF－1α在低氧环境中稳定表达［2］，是反映低氧状态的敏感指标。本研究采用酵母和腺嘌呤建立尿酸性肾病大鼠模型，发现模型组大鼠肾脏HIF－1α表达水平明显升高，表明尿酸性肾病大鼠肾脏存在缺氧状态。

TSP－1是一种内源性的强烈抑制血管生成因子，且高表达于整个肾纤维化过程中［7］。本研究同时发现，模型组大鼠肾脏TSP－1表达水平亦明显升高，且与HIF－1α的表达水平呈正相关。肾间质纤维化机制可能与TSP－1表达增加进而抑制血管生成，PTC密度减少，组织缺氧状态加重有关。尿酸可激活肾素－血管紧张素系统 (RAS)，改变肾脏血流动力学，升高球内压，并可直接促进肾脏纤维化进展［8］。血管紧张素受体拮抗剂 (ARB)因可降低血压，减少尿蛋白而起到肾脏保护作用，临床上常用于慢性肾脏病的治疗［9－10］，但其分子机制尚未完全明确。研究发现血管紧张素Ⅱ可降低PTC密度，ARB奥美沙坦可以改善PTC减少引起的组织缺氧［11］。本研究结果发现，缬沙坦干预治疗3周后，肾间质纤维化程度减轻，TSP－1、HIF－1α表达较模型组均有所降低;5周后肾间质纤维化程度明显改善，TSP－1、HIF－1α表达较3周时升高，但均比模型组降低。本研究结果表明，尿酸性肾病大鼠肾间质纤维化与TSP－1表达增多导致微血管丢失，加重组织缺血缺氧有关。缬沙坦可能通过减少微血管丢失、改善肾脏缺氧状态从而起到保护肾脏的作用。

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