ARK5和基质金属蛋白酶2在小细胞肺癌中的表达及其临床意义

陶 蓉，邱世超，侯成浩，李梦云，宿 超，李 慧，王云甲，史立宏，张宝刚，郑世良

浸润和转移是恶性肿瘤重要的生物学特征之一，许多临床医生都关注到这一问题，并进行了不懈努力和探索，但针对恶性肿瘤的浸润和转移对策却无明显进展，目前其仍然是临床治疗失败和死亡的主要原因。肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率已位居恶性肿瘤的第1位，并且仍呈上升趋势。肺癌易发生浸润和转移，5年生存率远低于其他恶性肿瘤。2003年由 Suzuki等［1］发现的 ARK5(AMPK －related protein kinase 5)又称NUAK1，是AMPK亚家族的成员，是Akt的下游信号分子。Akt被认为在肿瘤细胞的侵袭中具有关键作用［2－4］。ARK5作为Akt的下游信号因子，也被认为是肿瘤浸润和转移相关蛋白。相关研究表明，ARK5在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌的浸润、转移中起到不同程度的作用［5－8］。基质金属蛋白酶2(MMP－2) 是十分重要的促进肿瘤转移和侵袭的因子，在相关的研究中证明ARK5能刺激MMP－2的表达并促进其分泌。目前，国内外对ARK5在肺癌中的临床研究较少，尚未发现相关报道。所以ARK5在肺癌患者癌组织中的表达及其临床作用的研究十分必要。本研究检测ARK5和MMP－2在小细胞肺癌 (SCLC)患者癌组织中的表达情况，同时分析了ARK5和MMP－2与SCLC患者临床病理特征及预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2003年1月—2011年1月在潍坊市人民医院、潍坊医学院附属医院、第二人民医院经纤维支气管镜、CT引导下经皮肺穿刺活检、手术切除并经病理结果证实的SCLC患者106例的手术标本为SCLC组，其中男79例，女27例; ＜60岁54例，≥60岁52例;肿瘤直径＜4 cm 60例，≥4 cm 46例;低分化21例，中分化70例，高分化15例;Ⅰ期54例，Ⅱ期16例，Ⅲ期32例，Ⅳ期4例;T1期+T2期80例，T3期+T4期26例;N0期72例，N1～3期34例。术前均未化疗或放疗，未给予CAPli等生物治疗，取得标本后常规病理检查，并明确诊断，且具备完整的临床资料。另选取同时期其他疾病切除的肺组织标本40例为对照组，其中男29例，女11例; ＜60岁21例，≥60岁19例;病因:肺大疱18例，支气管扩张13例，肺脓肿9例。两组性别构成和年龄分布具有均衡性。

1.2 免疫组化检测ARK5和MMP－2的表达 术后标本立即用10%甲醛固定，送达病理科，由病理科专门技术人员进行常规石蜡包埋、切片，每层切片厚度4 μm。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，应用免疫组化SP法 (免疫组化二抗SP试剂盒由北京中杉生物公司生产，兔抗人ARK5和MMP－2多克隆抗体由美国Sigma公司生产)由专人按照试剂说明书严格进行操作。

1.3 结果判断 由两位具有丰富经验的病理科医师阅片后共同决定。全部切片均采用双盲法进行操作。发现细胞质呈浅黄色、黄色或棕黄色即可判断为ARK5和MMP－2阳性表达。操作时，通常都是随机选择10个高倍镜视野 (400倍)，每个视野连续计数100个细胞，共计数1 000个细胞。最后表达以染色强度和阳性细胞率的得分之和进行判断:强染色记3分，中等染色记2分，弱染色记1分，无染色记0分;另一方面阳性细胞率＜5%记0分，5% ～25%记1分，26% ～50%记2分，＞50%记3分。每例患者各项得分做好记录，再将上述两项得分相加做出判断结果:≥3分为阳性，＜3分为阴性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件包进行分析。计数资料采用 χ2检验或 Fisher精确检验;相关分析采用Spearman秩相关分析;单因素生存分析采用Kaplan－Meier生存曲线和Log－rank检验;多因素生存分析采用Cox多因素分析模型。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ARK5和MMP－2检测结果 电子显微镜高倍镜视野显示，SCLC组织中，ARK5主要定位于细胞质，正常肺组织中不表达;MMP－2主要定位于细胞质和细胞膜，正常肺组织中主要为阴性表达，间质细胞有少量表达 (见图1)。SCLC组ARK5和MMP－2阳性率分别为67.9%(72/106)和65.1%(69/106)，对照组中分别为5.0% (2/40)和7.5% (3/40)，差异均有统计学意义 (χ2值分别为46.004和38.540，P＜0.05)。

2.2 ARK5和MMP－2的表达与SCLC患者临床病理特征的关系 ARK5和MMP－2的阳性率与肿瘤直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期有关 (P＜0.05)，而与性别、年龄无关 (P＞0.05，见表1)。

表1 ARK5和MMP－2的表达与SCLC患者临床病理特征的关系Table 1 Expression of ARK5 and MMP－2 in SCLC patients and its correlation with the clinicopathologic features

2.3 ARK5和MMP－2相关性分析 经Spearman秩相关分析发现，SCLC癌组织中ARK5与MMP－2呈正相关 (r=0.878，P＜0.001)。

2.4 生存分析 Kaplan－Meier生存曲线显示，ARK5阳性组5年生存率为12.9%，阴性组为59.6%，差异有统计学意义(χ2=30.077，P＜0.001);MMP－2阳性组5年生存率为16.3%，阴性组为62.3%，差异有统计学意义 (χ2=24.405，P＜0.001，见图2)。

注:A:正常肺组织ARK5的表达，B:SCLC癌组织ARK5的表达，C:正常肺组织MMP－2的表达，D:SCLC癌组织MMP－2的表达

图2 Kaplan－Meier累计生存时间曲线分析Figure 2 Kaplan－Meier cumulative survival time curve analysis

2.5 Cox多因素回归分析 以SCLC患者死亡为因变量，以ARK5、MMP－2、肿瘤直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、肿瘤分期为自变量 (见表2)，纳入Cox多因素分析模型，结果显示，ARK5、分化程度、肿瘤分期与SCLC患者的预后差异有统计学意义 (P＜0.05，见表3)。

表2 SCLC患者预后影响因素的赋值Table 2 Assignment of factors affecting the prognosis of SCLC patients

表3 SCLC患者预后影响因素的Cox多因素回归分析Table 3 Cox variables of factors affecting the prognosis of SCLC patients

3 讨论

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，影响肺癌患者预后的最根本的原因是肺癌细胞的侵袭与转移，这也是困扰临床医生的主要问题，因此关于肺癌细胞的侵袭与转移的研究得到了许多临床医生的广泛重视。虽然，近年来对肺癌发展和演进过程中的癌症相关基因研究进展较快，但肺癌确切的发病原因、发病机制，尤其是相关基因具体作用以及浸润和转移的机制仍不明确。

ARK5是AMP激活蛋白酶 (AMPK)亚家族的成员，是Akt的下游信号分子。文献报道，ARK5在促进肿瘤的发生和抑制肿瘤细胞的凋亡过程中起到一定作用［9］;另外研究表明，Akt－ARK5途径与肿瘤恶性程度及其浸润和转移都有密切关系［9－10］。相关研究已表明，ARK5不但在乳腺癌、卵巢癌的浸润、转移中起到不同程度的作用，而且在胰腺癌、直肠癌的浸润、转移中也起到不同程度的作用［5－8］，但其在SCLC中的作用尚未见报道。本研究结果显示，ARK5和MMP－2的异常表达均与SCLC的肿瘤直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移和肿瘤分期密切相关，这与文献报道基本一致［8］。提示ARK5和MMP－2参与了肿瘤的分化、增殖，尤其是侵袭和转移。本研究还显示，ARK5和MMP－2的表达呈正相关，这就说明两者有密切相关。生存分析显示，ARK5和MMP－2的高表达均预示SCLC患者预后不良，其中ARK5是SCLC患者独立预后危险因素。

降解破坏细胞外基质和基底膜被认为是肿瘤转移各个阶段中的关键步骤之一。MMPs作为一种重要的蛋白水解酶家族，可以降解细胞外基质 (ECM)和基底膜成分以及一些非基质成分，从而改变肿瘤细胞的微环境，促进恶性肿瘤发生和发展，尤其是转移和侵袭。

MMP－2是目前发现的与肿瘤侵袭关系最为密切的一种MMPs，可激活MMP－9［11］，两者均是最重要的MMPs家族之一，临床上有重要的作用。胃癌的转移侵袭已被证实与MMP－2和MMP－9的过表达密切相关［12－13］，这就为胃癌早期转移提供了简单实用的检测方法，有利于胃癌的临床治疗。ARK5基因的过表达可通过调控 MT1－MMP的增加引起MMP－2基因的激活并刺激其分泌，这点已被Suzuki等［14］发现，从而证明了MMP－2是ARK5的下游信号分子。

尽管ARK5及MMP－2都被证实在肿瘤的发生、转移、侵袭中有一定的作用，但它们具体的作用机制及相互调控关系仍未完全阐明。Suzuki等［14］进一步猜测，由于癌组织血供不足和缺氧导致Akt的激活和AMP生成增加，进而激活ARK5，导致对营养饥饿的耐受和MT1－MMP产物的上调，激活了MMP－2，从而刺激了肿瘤的侵袭和转移。

总之，SCLC癌组织中ARK5和MMP－2均过表达，与肺癌的浸润、转移、分化相关。因此，可以通过检测ARK5和MMP－2的表达来判断肺癌的转移情况和预后，了解病情严重程度，寻求抑制ARK5高表达的方法，来抑制肿瘤浸润转移，为肿瘤的靶向治疗提供新的靶点，增加临床疗效，改善肺癌的不良预后，同时为肿瘤发病机制的研究提供新方法。

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