食源性致病菌焦磷酸通用引物测序方法的建立

赵新，王永，兰青阔，陈锐，朱珠，余景会，李欧静，郭永泽

（天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津 300381）

食品安全是人们近年来较为关注的话题，而食源性致病菌是诱发食品安全问题的重大因素之一。因而，建立一种准确快速的检测致病菌的方法一直是研究的热点[1-2]。传统的鉴定方法繁琐费时，将细菌分离培养与PCR及杂交探针、基因芯片等技术手段相结合[3-4]，具有耗时短、重复性好等优点，但无法得到目的基因序列信息，存在假阳性的偏差，且多需进行凝胶电泳。

焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无需进行电泳，DNA片段也无需荧光标记，从而能够真正达到快速、准确的鉴定病原微生物的目的，且操作极为简便[5]。

选取食源性致病菌中较为常见和典型的4种致病菌（沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌），利用16SrRNA高度保守区序列和可变区序列设计一组通用引物，同时检测和鉴定4种致病菌，经验证得到与国标方法一致的检测结果，可用于食源性致病菌的快速检测和鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准菌株

乙型副伤寒沙门氏菌CMCC（B）50094、甲型副伤寒沙门氏菌CMCC（B）50433、鼠伤寒沙门氏菌CMCC（B）50013、痢疾志贺氏菌 CMCC（B）51592、福氏志贺氏菌 CMCC（B）51571、鲍氏志贺氏菌 ATCC 9207、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、单增李斯特氏菌CMCC（B）54002共8株常见的危害人和动物的食源性致病菌，均为本室购买标准菌株。菌株复苏后接种于相应的增菌培养基中过夜培养。

1.1.2 主要试剂和仪器

特异性扩增引物和测序引物：上海生工合成；Go－TaqRMaster Mix溶液：Promega公司；Sepharose Bead、binding buffer、Annealing Buffer、底物、酶和 A、C、G、T四种碱基：Biotage公司；定量遗传分析仪：基因有限公司；PCR扩增仪：ABI Veriti及ABi 2720；凝胶电泳设备：BIO－R AD Power200；凝胶成像系统：SYNGENE 公司产品。

1.2方法

1.2.1 引物的设计与合成

通过基因库数据检索网站 NCBI、KEGG和ClustalW程序分别对沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的16SrR NA保守序列进行同源性分析，寻找适合的通用测序序列[6]；再应用焦磷酸测序仪配套专业软件设计适合沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的焦磷酸测序通用扩增和测序引物。

1.2.2 细菌DNA的提取

取选择性增菌后菌液100 μL，100℃煮菌10 min，立即－20℃，冰浴10 min，微型离心机离心 2 min～3 min，上清极为细菌DNA模板，备用。

1.2.3 PCR反应体系及扩增程序

扩增反应的总体积为50 μL，其各种成分分别为：2×GoTaqRMaster Mix 25 μL，10 μmol/L 引物各 1 μL，模板 DNA 2 μL，用灭菌去离子水补齐至 50 μL；反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸 30 s，循环40次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。

1.2.4 测序单链的制备

将3 μL链亲和素包被的磁珠和47 μL的binding buffer混匀，然后加入到 50 μL的 PCR产物中，1 300 r/min～1 400 r/min，室温振荡混匀 10 min～15 min；在PSQ Low反应板中预先加入40 μL含有0.3 μmol/L测序引物的Annealing Buffer；在Vacuum prep workstation中，进行单链制备，备用。

1.2.5 测序反应体系

测序反应的总体积约为150 μL，其中各种成分分别为：PCR产物 50 μL，Sepharose Beads 3 μL，Binding Buffer 47 μL （10 mmol/L Tris－HCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.1%Tween20，pH7.6），10 μmol/L 测序引物 1.2 μL，Annealing Buffer 38.8 μL （20 mmol/L Tris－AC，2 mmol/L MgAC2，pH7.6），再根据软件提示在试剂舱相对应位置加入所需的底物，酶和A、C、G、T。

1.2.6 测序反应程序

采用SQA模式，按照CGCGACGCTAGCGTCT的碱基排列顺序进行测序。

1.2.7 添加灵敏度对比试验

将四种致病菌菌液分别进行10倍梯度稀释，筛选出 105、104、103、102、10、1、0 CFU/mL 的菌悬液，各取1 mL添加于24 mL无菌牛奶样本中，备用。将上述一系列25 mL牛奶样本按照传统国标方法增菌，并进行后期生化鉴定[7－10]；同时将增菌后的典型菌落，用煮菌法提取模板DNA，用于PCR扩增而后进行焦磷酸测序。

2 结果

2.1 引物设计结果

通过NCBI、KEGG等数据库的检索，获得沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的相关序列，并通过ClustalW程序进行同源性分析，应用焦磷酸测序仪配套专业软件分别对四种菌的16SrR NA保守序列进行同源性分析，通过序列比对发现四种菌的16SrR NA序列同源性适度，且又存在差异，适合设计焦磷酸测序通用扩增引物和测序引物，引物设计情况见表1。

表1 通用扩增引物和测序引物序列Table 1 PCR amplification primers and sequencing primers

2.2 PCR反应扩增结果

扩增反应的总体积为50 μL，其各种成分分别为：2×GoTaqRMaster Mix 25 μL，10 μmol/L 引物各 1 μL，模板 DNA 2 μL，用灭菌去离子水补齐至 50 μL；反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环40次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。取PCR产物5 μL用2%的琼脂糖凝胶电泳，均能扩增出目的片段大小的单一条带，结果见图1。

图1 四种食源性致病菌通用引物PCR扩增产物的电泳分析图谱Fig.1 Result of PCR amplification of Four Kinds of Food-borne Pathogenic Bacteria

2.3 焦磷酸测序结果

根据对四种食源性致病菌16SrRNA序列分析，设计通用扩增引物和测序引物，四种食源性致病菌均可用一组16SrRNA扩增引物得到高浓度的PCR产物，再通过同一条测序引物分析四种食源性致病菌的差异位点，已知位点差异分别为：沙门氏菌CGC ACG CAG GCG GTCT；金黄色葡萄球菌CGCGCGTAGGCGGTTT；志贺氏菌CGCACGCAGGCGGTTT；单增李斯特菌CGCGCG CAGGCGGTCT，经本实验方法焦磷酸测序后结果与已知位点差异完全吻合，焦磷酸测序结果见图2～图5，4种食源性致病菌位点差异模拟图见图6～图9。

图2 沙门氏菌扩增产物测序结果图Fig.2 Result of Pyrosequencing of Salmonellla spp

图3 金黄色葡萄球菌扩增产物测序结果图Fig.3 Result of Pyrosequencing of Staphylococcus aureus

图4 志贺氏菌扩增产物测序结果图Fig.4 Result of Pyrosequencing of Shigella spp

图5 单核细胞增生李斯特菌扩增产物测序结果图Fig.5 Result of Pyrosequencing of Listeria monocytogenes

图6 沙门氏菌位点差异模拟图Fig.6 Simulation chart of site difference of Salmonellla spp

图7 金黄色葡萄球菌位点差异模拟图Fig.7 Simulation chart of site difference of Staphylococcus aureus

图8 志贺氏菌位点差异模拟图Fig.8 Simulation chart of site difference of Shigella spp

图9 单核细胞增生李斯特菌位点差异模拟图Fig.9 Simulation chart of site difference of Listeria monocytogenes

2.4 添加灵敏度对比试验结果

四种食源性致病菌的传统国标方法鉴定结果为105、104、103、102、10 CFU/mL 的添加样品均检出，1 CFU/mL和0 CFU/mL的添加样品未检出；焦磷酸测序方法测序结果为 105、104、103、102、10 CFU/mL 的添加样品均检出，1 CFU/mL和0 CFU/mL的添加样品未检出。由此可见，焦磷酸测序方法与传统国标的生化鉴定方法完全可达到相同的灵敏度，但省去了后期繁琐而费时的生化鉴定步骤，结果见表2。

表2 焦磷酸测序及国家标准方法检测灵敏度比较结果Table 2 Comparative sensitivities of Pyrosequencing and National standard method

3 结论

传统国标法的生化培养一直是食源性致病菌检测方法的金标准，但随着食品安全问题各种应急预案的不断发生，生化培养的较长时间已逐渐造成应急预案在最短的时间内判读和控制的困扰，因此各种快速检测技术不断涌现，免疫学法、测试片法、PCR方法、LAMP技术等等，而这些快检技术都存在着自身相应的不足，比如，免疫学方法假阴性高，人为要求操作水平影响较大；测试片储存时间极短，一旦开封剩余测试片储存时间最多两个月，且不易保存；PCR方法存在气溶胶污染；LAMP方法，易出现假阴性、假阳性的结果，且结果不易稳定，那么无疑测序技术是目前相关技术中最本质的从基因序列水平判读结果的方法，可靠性大大增强。

焦磷酸测序技术较传统的Sanger金标法具有其独特的优势，焦磷酸测序技术可以应用于短片端序列的判读，可直接判读测定引物后面的模板序列，无需电泳，也无需荧光染色，操作简便，成本相对较低，且一次可完成96个样本的检测，通量高；检测实时快速，20 bp左右的序列，仅需10多分钟即可完成。

不同细菌的16SrRNA由于其基因既具有高度保守序列，又具有各自特有的多变序列，因此被公认为细菌种属水平检测的专属基因。利用这一特性，近年来也建立了一些能同时检测多种细菌的PCR方法，如PCR-限制性内切酶片段分析[11]，PCR-反向斑点杂交[12-13]等，但这些方法操作复杂，分析繁琐，不适用于应急预案快速准确的判读。

本研究通过构建一组通用引物，同时得到四种食源性致病菌的高浓度PCR单一产物，利用测序引物，通过四种菌可变区2个～3个碱基位点差异，判读细菌不同种属。测序结果与传统国标法比较，得到了100%的吻合率，且具备较高的灵敏度。由此证明本研究所建立的焦磷酸测序方法适合于食源性致病菌的快速检测，且将微生物检测基于分子水平的研究，实现了在基因水平上对致病微生物进行最本质的序列分析及鉴定[14-15]。

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