氨基酸对呕吐毒素诱导的肥育猪血液生理生化损伤的干预效应

陈明洪 ，尹 杰 ，邓建文 ，吴苗苗 ，肖 昊 ，段杰林 ，方 俊 ，李铁军

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.中国科学院亚热带农业生态研究所，中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室，湖南省畜禽健康养殖工程技术中心，农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站，湖南 长沙 410125；3.中国科学院大学，北京 100049；4.湖南农业大学动物科技学院，湖南 长沙 410128）

呕吐毒素（vomitoxin）的主要成分是脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）。DON是一种单端孢霉烯族毒素，它是一种由镰刀菌属产生的毒性代谢产物，现已证实禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌为主要产毒菌种[1]。DON在全球范围内广泛存在，其在全世界范围都具有较高检出率[2-3]。由于DON在不同动物体内有着不同的吸收、代谢、分布和排出的方式，因此不同动物对毒性敏感性也存在差异，其毒性作用大小依次为：猪、小鼠、大鼠、家禽和反刍动物[4]。呕吐毒素能引起猪食欲下降、呕吐、体重减轻、流产、死胎和弱仔等现象，抑制机体免疫力和降低抵抗力[5-6]。不仅如此，DON还具有细胞毒性和遗传毒性，能抑制生物大分子如DNA、RNA、蛋白质的合成[7]，诱导细胞发生凋亡[8-9]。目前有关DON脱毒处理主要为物理、化学和生物脱毒方法，而从营养角度的研究尚无报道。功能性氨基酸（如谷氨酸、精氨酸、赖氨酸等）是机体中肠道细胞、淋巴细胞等快速分裂细胞的主要氮源和能量来源，在疾病的预防、控制感染以及机体损伤后的修复等过程中具有营养和免疫调节双重作用[10-12]。试验研究了饲粮添加酸性氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸）和碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）对呕吐毒素诱导的育肥猪脏器指数、血液常规指标和血液生化的损伤进行营养干预，以期从营养的角度为缓解呕吐毒素的毒害作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

平均体重约为55 kg的二元杂（长×大）肥育猪30头；F.graminearum R6576菌种（华中农业大学）；基础饲粮配方参照NRC（1998猪营养需要标准（表1）；谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）。

1.2 饲粮处理

选用PDA培养基，121℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却后在超净工作台接F.graminearum R6576菌种，置于28℃恒温培养箱中培养5～6 d，将菌丝接种在羧甲基纤维素酯培养基（Carboxymethyl Cellulose，CMC）中，用接种针将菌丝打碎，1 L三角瓶中加入CMC液体培养基220 mL，置于28℃，200 r/min的恒温振荡摇床上培养5 d。将基础饲粮平铺于室内，厚度适中，然后将处理好的每CMC液体培养基溶液按40 mL/kg均匀喷洒在基础饲粮上，搅拌，混匀。处理过程中保持饲料含水量均匀且相对湿度在20%左右，温度28℃左右，处理7 d。将处理好的饲粮与未处理的基础饲粮按1∶1混合均匀，按试验设计要求加入分别加入氨基酸。试验周期为60 d，共处理饲料8次，每次每组取样2份装入干净自封袋中，标记日期及组别，－20℃保存，用于检测DON含量。

1.3 试验设计

健康肥育猪30头，随机分为6组，每组5头，每头为1个重复。分别为：CK组（基础饲粮）、DON组（饲粮添加3.4 mg/kg呕吐毒素）、Glu组（3.4 mg/kg呕吐毒素＋2%Glu）、Asp组（3.4 mg/kg呕吐毒素＋2%Asp）、Arg组（3.4 mg/kg呕吐毒素+1%Arg）和 Lys组（3.4 mg/kg呕吐毒素＋1%Lys）。试验育肥猪饲喂至出栏（60 d，体重100 kg左右）。

1.4 样品采集及测定

1.4.1 血常规检测 于屠宰前1 d，清晨对空腹育肥猪用无菌注射器前腔静脉采血10 mL/头。将血液静置15 min，3000 r/min离心20 min分离血清，分装于EPPendorf管中，4℃保存，待测。用血液分析仪（南昌百特HL-2400）进行白细胞计数（WBC）、淋巴细胞百分（LYMPH）、中间值细胞百分比（MID）、中性粒细胞百分比（GR）、淋巴细胞绝对值（LYMPH）、中间值细胞绝对值（MO）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞比积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、红细胞体积分布（RV）、平均血小板体积（MPV）、血小板压积（PCT）和血小板分布宽度（PDW）等项目测定。

表1 基础饲粮配方及营养水平 （%）

1.4.2 血清生化指标测定 同1.3.1采血样，用BECKMAN公司CX4型全自动血液生化分析仪进行血清丙氨酸转氨酶（ALT）、白蛋白（ALB）、γ-谷氨酰转移酶、总蛋白（TP）和血糖（GLU）等指标测定。

1.4.3 脏器指数测定 所有试验育肥猪试验60 d屠宰。打开腹腔，分离心脏、肝脏、脾脏和肾脏，称重记录数据。脏器指数=脏器绝对重量/体重（g/kg）。

1.5 数据处理

试验数据先用Excel 2003进行初步统计，然后用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析和Duncan氏多重比较，以P＜0.05为差异显著性标准。试验数据以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 对脏器指数和肝脏形态学的影响

受呕吐毒素的影响，心脏指数下降，其余脏器均有上升趋势（见表2），但差异不明显（P>0.05）。对于脾脏指数而言，添加1%的Lys较其余氨基酸组显著下降（P＜0.05），但对于缓解呕吐毒素对其影响效果不明显（P>0.05），而酸性氨基酸与碱性氨基酸均能提高心脏、肝脏、脾脏和肾脏指数，从整体上来看，酸性氨基酸和碱性氨基酸对肥育猪脏器指数的缓解效果差异不显著（P>0.05）。

2.2 对血液常规参数的影响

从表3中可知，与CK组相比，DON组白细胞数、中间值细胞百分比、中性粒细胞百分比、淋巴细胞绝对值、中间值细胞绝对值、血红蛋白、平均红细胞体积、平均血小板体积、血小板压积均有所升高，其中平均血小板体积差异显著（P＜0.05），其余差异不显著。而与DON组比较，碱性氨基酸组中，添加1%Lys能显著提高红细胞数量（P＜0.05），而酸性氨基酸组的红细胞数与DON组并无明显差异。酸性氨基酸组中，添加2%Glu能显著改善平均血小板体积（P＜0.05），而碱性氨基酸组的平均血小板体积与DON组差异不大，总体而言，4种氨基酸均能在一定程度上对呕吐毒素诱导的肥育猪血液常规参数起到一定缓解作用，缓解效果的差异不显著。

2.3 对血液生化指标的影响

肥育猪血液生化指标检测结果见表4，与CK组比较，摄食呕吐毒素的肥育猪血液中ALT含量有所下降，ALB、γ-谷氨酰转移酶、TP和GLU均有不同程度上升，但差异均不明显（P>0.05），与DON组比较，酸性氨基酸组中Asp组和碱性氨基酸组中Lys组均能呢能使ALT和γ-谷氨酰转移酶含量降低，且差异显著（P<0.05），Glu组ALB酶含量显著下降（P<0.05），Arg TP 含量显著下降（P<0.05），Glu、Arg、Asp均对呕吐毒素诱导的肥育猪GLU含量升高有一定的缓解效果，但效果不显著（P>0.05）。

表2 氨基酸对呕吐毒素诱导的肥育猪脏器指数的干预效应 （g/kg）

3 讨论

3.1 对脏器指数的影响

动物脏器指数即动物的脏器重量与体重之比，是生物医学研究的重要基础指标[13]，它不仅是进行病理学、毒理学研究和探讨发病机理等研究时选择动物的依据[14]，而且能够反映脏器本身的结构改变及生理性功能状态[15-17]。Wenkai指出[12]，功能性氨基酸在多种机体模型中均有缓解效果。试验结果表明，与CK组比较，DON对肥育猪心脏指数的影响与伍力等[11]研究结果不同，导致这种现象的具体原因尚不清楚，可能是由于动物种类与毒素计量不一致导致。而与DON处理组比较，酸碱性氨基酸组肥育猪心脏、肝脏、脾脏和肾脏指数影响大多呈上升趋势，且相比其他氨基酸组，添加1%Lys使脾脏指数下降。这一现象可能原因为人工处理的DON污染饲粮，毒性作用不强，肥育猪长时间食用含低剂量DON的日粮，对DON具有一定的耐受能力。

表3 氨基酸对呕吐毒素诱导的肥育猪血常规参数的干预效应

3.2 对血常规参数的影响

血液由液体和有形细胞两大部分组成，血常规检验的是血液的细胞部分。血液不停地流动于机体循环系统中，参与机体的代谢及每一项功能活动，

表4 氨基酸对呕吐毒素诱导的肥育猪血液生化指标的干预效应

因此血液对保证机体的新陈代谢、功能调节以及内外环境的平衡起重要作用。血液中的任何有形成分发生病理变化，都会影响到组织器官。Tiemann等[18]报道DON具有较强的细胞毒性，影响细胞增殖，从而导致细胞数量下降。赵青等[19]用DON标准品为原料，通过灌胃和静脉注射2种给药途径，研究该毒素对猪体内血常规指标的影响，发现2种方式均对猪血常规参数不会造成显著影响。试验中饲喂呕吐毒素能刺激白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、中间值细胞、血红蛋白的增值，但无显著性差异，这一试验结果与赵青等[19]人报道相符。平均血小板体积显著上升，表明DON能够引起肥育猪机体内炎症反应，而添加2%Glu能使情况显著改善。原因可能是由于谷氨酸能够通过iNOS途径在大脑组织中表达，间接调节动物免疫活性[20]，对平均血小板的作用还可能与Glu参与神经调节有关。

3.3 对血液生化的影响

血液生理生化是反映动物机体生理机能的重要指标，也是临床医疗和科学研究的重要依据[21]。何成华[22]分别用1和1.5 mg/kg DON对鲤鱼进行攻毒，结果表明鲤鱼血清中GOT、GPT和AKP活性上升，且GOT活性显著上升，血清中TP、ALB含量是反映肝脏蛋白质合成能力的重要指标。血清中TP含量反映了机体蛋白质的吸收和代谢情况，并能反映体液免疫的情况。在DON的刺激下，肥育猪血液中ALT、ALB、γ-谷氨酰转移酶、TP和GLU均出现不同程度上升，而γ-谷氨酰胺转移酶和ALT是反映肝脏病变的两个重要指标，TP和ALB也能够一定程度上反映肝脏的合成功能，这说明呕吐毒素已经对肥育猪肝脏造成一定程度的损伤。而添加2%Glu和添加1%Lys能使ALT和r-谷氨酰转移酶含量显著降低，添加2%Glu使ALB酶含量显著下降，1%Arg使TP含量显著下降。原因可能是动物长期进食含呕吐毒素的饲粮使机体处于长时间应激状态，对肝脏解毒功能造成影响。添加的4种氨基酸都能显著改善饲喂DON肥育猪的血液生化指标，调节肝功能障碍，对DON造成的负面影响有缓解效果。

4 结论

饲粮中添加3.4 mg/kg的呕吐毒素对肥育猪脏器指数、血液常规指标和血液生化指标造成了不同程度的损伤，而添加酸性氨基酸（Glu、Asp）和碱性氨基酸（Arg、Lys）对于缓解脏器病变、改善血液生理生化指标具有一定的效果。

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