尿素包合法提纯d——亚麻酸的研究

□李佩洪 龚 霞 唐 伟 张红粒 吴银明

四川是花椒生产和消费的主要地区，目前花椒已经被开发出了形式多样的产品，但是花椒籽却没有被很好地利用起来。其实，花椒籽中含有丰富的油脂(2 0％～2 5％)，其油脂中含有1 7％～2 4％的α-亚麻酸和2 5％～3 2％的亚油酸，多种不饱和脂肪酸总量达4 2％～5 6％，经精炼、脱色的花椒籽油中A L A的含量可达3 0％以上。A L A是人体必需的脂肪酸，对维持人体大脑和视网膜的正常发育具有重要作用。因此，花椒籽油中A L A的纯化有可能成为花椒籽的有效利用途径。

一、尿素包合法原理

尿素包合法分离混合脂肪酸酯，是基于脂肪酸的不饱和程度和碳链长度不同的特点而进行的。当尿素溶解于乙醇等有机溶剂中，遇到直链脂肪酸、酯、醇等有机物时，尿素分子之间通过强大的氢键，在有机物分子周围形成宽大的六方晶系，即尿素包合物。尿素与脂肪族化合物形成包合物的基本条件是：第一，碳链必须大于4个碳原子；第二，碳链必须是直链。尿素包合法是一种较好的混合脂肪酸分离纯化的方法，其尿素包合能力：棕榈酸＞硬脂酸＞油酸＞亚油酸＞A L A，由于A L A双键较多，具有一定的空间结构，不易被尿素包合，采用过滤方法将尿素包合物除去，就可得到富含A L A的脂肪酸产品。

二、材料与方法

1.原料 花椒籽油，由陕西韩城颜联祥老师提供。

2.仪器与试剂 高效液相色谱仪（安徽皖仪）、真空泵（巩义瑞德S H Z-D(Ⅲ)）、旋转蒸发仪(巩义瑞德)、恒温水浴锅（巩义瑞德R E-3 0 1）、电子天平（上海越平J A 2 0 0 3 B）、低温冰箱（海尔）、干燥箱（B P G-9 0 1 0 A）；氢氧化钠、盐酸、尿素、乙醇、石油醚、无水硫酸钠均为分析纯，冰乙酸、乙腈、甲醇均为色谱级，超纯水，α-亚麻酸标准品。

3.实验方法

（1）花椒籽油混合脂肪酸制备 椒籽油∶1.0 m o L/LNa OH-乙醇1∶4，在6 0℃水浴上加热回流4 0分钟至溶液澄清透明。取下烧瓶，冷却至室温后，加入适量石油醚以除去不皂化物。然后放入冰箱，使皂析出，减压抽滤除去过量乙醇。加入适量水，使皂溶解，再用1 0％盐酸调其p H值至2～3，转移到分液漏斗中，用石油醚萃取，静置分层，分取上层有机相水洗至中性，通过装有无水硫酸钠的漏斗，滤液于5 0℃水浴中减压旋转蒸发，回收石油醚，即得混合脂肪酸(F F A)。

（2）方法 ①单因素试验。按照不同的F F A∶尿素，尿素:乙醇比例，首先量取一定量的乙醇（9 5％），放入锥形瓶中，加入不同量的尿素，于6 5℃水浴。待尿素完全溶解后，加入一定量的混合脂肪酸(F F A)，混合均匀后，取出，于设定温度下包合不同时间。所得尿素包合物结晶抽滤分离，滤液加入适量石油醚，用1 0％盐酸酸化至p H值2～3，再加入适量水，充分萃取，静置分层，分离有机相，用石油醚多次萃取水相，合并有机相，用蒸馏水反复冲洗至中性。最后将石油醚层通过装有无水硫酸钠的漏斗脱水干燥，滤液旋转蒸发完石油醚，即得分离样品。②正交设计。根据单因素试验结果，按L 9(3 4)正交设计安排试验。

（3）色谱条件 用固定相为C 1 8柱，流动相为乙腈：1％乙酸溶液（9∶1）；检测波长为2 0 5 n m；流速为1.0 m L/分钟；柱温2 5℃；进样量2 0 μL。

三、结果与分析

1.混合脂肪酸与尿素的比例对提纯率的影响 尿素与9 5％乙醇的比例为1∶3，包合时间为1 2小时，包合温度0℃，F F A与尿素的比例对提纯率的影响如图1：

图1

由图1可知，F F A与尿素的比例越高，A L A的提取纯度越高，当F F A：尿素为1∶4时，A L A的浓度达到6 8.1 8％。

2.尿素与乙醇的比例对提纯率的影响 在F F A与尿素的比例为1∶2，包合时间为1 2 h，包合温度0℃，尿素与乙醇的比例对提纯率的影响如图2：

图2

由图2可知，A L A的纯度随尿素与乙醇的比例增大而增大，当尿素：9 5％乙醇为1∶3时，A L A的提取纯化率最高，达到5 8.2 4％，继续增大尿素与乙醇的比例，A L A的纯化率呈缓慢下降的趋势，可能是F F A更多的溶解在溶剂中没有被尿素包合。

3.包合温度对提纯率的影响 尿素与9 5％乙醇的比例为1∶2，在F F A与尿素的比例为1∶3，包合时间为1 2小时，包合温度对提纯率的影响如图3：

图3

由图3可知，整体呈现的趋势是包合温度越低，A L A纯化率越高，当温度为-2 0℃时，A L A的纯化率最高，达到了5 8.3 3％。在5℃时，A L A纯化率为5 4.7 7％，比2 0℃时，A L A纯化率5 4.9 6％时低，可能是试验中的误差导致的。

4.包合时间对提纯率的影响 尿素与9 5％乙醇的比例为1∶2，在F F A与尿素的比例为1∶3，包合温度0℃，包合时间对提纯率的影响如图4：

图4

由图4可知，包合时间对A L A纯化率的影响呈不规则变化，在包合1 2小时，A L A纯化率达到最大，为5 8.1 9％。这种不规则变化可能是由于尿素的包合过程与乙醇的溶解过程的相互转换造成的。

5.正交试验 根据单因素试验结果，设计L 9(3 4)正交试验表（如表1）。

表1 正交试验因素水平表

正交试验结果及分析见下表2、表3：

表2 正交试验结果表

表3 方差分析表

F检验结果表明，3个因素对产量的影响都不显著。由于各因素对A L A提取纯化率影响都不显著，不必再进行各因素水平间的多重比较。故从表2中选择平均数大的水平A 3、B 1、C 3组合成最优水平组合A 3 B 1 C 3。综合单因素试验和正交试验可以得出尿素包合法分离纯化花椒籽油脂中A L A的最佳工艺参数是：F F A：尿素=1∶5，尿素∶9 5％乙醇=1∶2.5，包合温度-2 0℃，包合时间为1 4小时，A L A的浓度百分比可达6 6.2 9％。

四、结论

试验结果表明，尿素包合法作为初步分离多不饱和脂肪酸的一种方法，具有简便、经济、高效等特点，所用试剂易得，均可回收，适合于工业化生产。但与其它富含α-亚麻酸的植物油脂，如亚麻籽油(4 0％～6 0％)、紫苏子油(5 6.1 4％～6 4.8 2％)等相比，花椒籽油中的α-亚麻酸，含量较低，分离难度较大，因此，要得到纯度较高的α-亚麻酸，还需结合其它分离方法，如低温结晶、多次尿素包合、硝酸银-硅胶柱层析等方法进一步纯化。