大枣中环磷酸腺苷的提取及体外抗过敏活性研究

王维有，曹晨晨，欧 赟，马秋月，王 宇，周 婕，任迪峰，* ，鲁 军

(1.北京林业大学生物科学与技术学院，北京林业大学林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京100083;2.中国食品发酵工业研究院，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京100027)

大枣(Fructus jujubae)为鼠李科植物，我国枣树种植面积占世界的98%以上［1］，资源相当丰富。环磷腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是一种重要的生物活性物质，广泛存在于植物细胞中［2］，具有重要的生理调节作用［3－4］，可用于调节免疫［5－6］、抑制哮喘［7］，并能有效治疗心肌梗塞、冠心病、牛皮癣等疾病。目前，国内外研究者对cAMP的应用表示出极大兴趣，正积极寻找获取这种天然药物的手段。针对枣中cAMP的提取，目前已建立了微波辅助萃取［8］、水提［9］等方法，但这些方法存在能耗大、时间长等不足。闪式提取是一种依靠高速机械剪切力和超动力分子渗滤的技术［10］，其通过强大的剪切力加速细胞破碎，以使其中的小分子溶出，因此具有操作简单、快速高效的特点。目前，还未有利用闪式提取技术分离大枣中cAMP的报道。另外，尽管国内外有不少关于cAMP的研究，但鲜有关于其抗过敏活性的报道。为了充分开发利用枣中的cAMP，本研究利用闪式提取法，通过正交实验确定大枣cAMP的最优提取工艺。在对提取液粗品进行纯化的基础上，进一步采用透明质酸酶体外抑制实验，对cAMP抗过敏活性进行初步探讨，旨在为大枣cAMP的深入开发和抗过敏应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大枣 早脆王枣(充分成熟)，采自北京林业大学沧州枣园基地;cAMP标准品(纯度99%)、甲醇(色谱纯)、无水乙醇(分析纯)、磷酸二氢钾(色谱纯)北京化学试剂公司;D101型大孔树脂 天津南开大学化工厂;透明质酸酶(分析纯)、透明质酸钾(分析纯)德国Sigma公司;对－二甲氨基苯甲醛、盐酸、硼酸、乙酰丙酮、碳酸钠等 均为分析纯，北京化工厂。

岛津LC－10A高效液相色谱仪 含LC－10ATvp泵，SPD－10A紫外检测器，C－R8A色谱数据处理仪，日本岛津;Venusil MP C18色谱柱 天津博纳艾杰尔科技有限公司;冷冻离心机 Sigma公司;KQ－500E型超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司;RE－5203旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;SHZ－88A往复式水浴恒温震荡器 太仓市实验设备厂;SHB－Ⅲ循环式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;PL403仪器电子天平 梅特勒－托利多;DZF－6050真空干燥机 深圳市三诺仪表有限公司;FA1604N电子分析天平 上海精密仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 制作标准曲线 将准确称取的标准品配成浓度分别为 1、3、5、10、15μg/mL 的溶液。分别取上述溶液各15μL注入高效液相色谱仪进行分析，色谱条件:色谱柱采用Venusil MP C18;流动相:20mmol/L磷酸二酸钾－乙醇(80∶20);流速1mL/min;温度为室温;检测波长256nm;进样量为15μL。按照色谱峰面积作出标准曲线。

1.2.2 提取大枣cAMP单因素实验 将早脆王枣清洗，去核，切片后真空干燥(70℃，95kPa)，粉碎过60目筛。准确称取早脆王枣粉10.0g，加入适量体积、适当浓度的乙醇混匀，按照料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取次数等条件进行闪式提取，提取液以8000r/min离心两次，合并上清液后过0.45μm滤膜，采用高效液相色谱法测定cAMP含量，cAMP提取率计算公式如下:

cAMP提取率(μg/g)=提取液中cAMP质量(μg)/早脆王枣枣粉质量(g)式(1)

1.2.2.1 提取溶剂浓度的影响 10.0g枣粉加入150mL乙醇中，设定料液比1∶15，提取10s，提取2次，乙醇体积分数分别为0、15%、30%、45%、60%、75%、90%，按照1.2.2的操作方法测定cAMP含量。

1.2.2.2 料液比的影响 10.0g枣粉分别按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 加入乙醇，设定乙醇体积分数60%、提取10s、提取2次，按照1.2.2的操作方法测定cAMP含量。

1.2.2.3 提取时间的影响 10.0g枣粉加入150mL乙醇中，设定料液比1∶15、乙醇体积分数60%、提取2次，提取时间分别为20、40、60s，按照1.2.2的操作方法测定cAMP含量。

1.2.2.4 提取次数的影响 10.0g枣粉加入150mL乙醇中，设定料液比1∶15、乙醇体积分数60%、提取10s，提取次数分别为 1、2、3、4 次，按照1.2.2 的操作方法测定cAMP含量。

1.2.3 正交实验 在单因素实验的基础上，选定乙醇体积分数、提取时间、料液比和提取次数做正交实验(表1)，以cAMP提取率为指标，获得cAMP的最优提取工艺。

表1 正交实验设计表Table 1 Design of the orthogonal experiment

1.2.4 大枣cAMP粗提物的纯化 研究表明，D101型大孔树脂适合大枣cAMP提取液的纯化［11］。取适量D101型大孔吸附树脂，用95%乙醇浸泡12h后水洗至中性;继续用5%HCl浸泡6h，水洗至中性;再用5%NaOH浸泡6h，水洗至中性;最后用蒸馏水洗至中性。将处理好的树脂用乙醇湿法装柱，随后，分别对最大上样体积、洗脱液浓度、洗脱流速进行考察。

首先将 cAMP提取液浓缩至 20μg/mL，以1.5BV/h的流速上样，每1h收集一管，每管9mL，收集各时期洗脱液，过0.45μm微孔滤膜，进行cAMP含量测定并绘制泄露曲线。

再取过量cAMP提取液，上样后静置吸附12h。以10%乙醇洗脱样品，流速分别采用0.5、1、1.5BV/h，收集各时期洗脱液，过0.45μm微孔滤膜，进行cAMP含量测定。

最后，取适量cAMP提取液上样6h后静置吸附12h，改变乙醇体积分数分别为20%、30%、40%和50%，以1BV/h的流速洗脱样品，收集各时期洗脱液，过0.45μm微孔滤膜，进行cAMP含量测定。

1.2.5 大枣cAMP提取物抗过敏活性的测定

1.2.5.1 透明质酸酶体外抑制率的测定 采用透明质酸酶体外抑制实验法(E1son－Morgan法)测定提纯后的cAMP提取物的抗过敏活性。将2.5mmol/L的CaCl20.1mL加入0.5mL透明质酸酶(500U/mL)中，37℃保温20min;加入待测液0.5mL，37℃保温20min;加入0.4mg/mL透明质酸钠液0.5mL，37℃保温40min后常温放置5min，加入0.4mol/L NaOH溶液0.1mL，水浴10min，加入乙酰丙酮碳酸钠溶液0.5mL，沸水浴15min，用水冷却;加入3mL无水乙醇10mL，再加入埃尔利试剂1.0mL，混匀，常温放置20min后，于530nm处测定吸光值。

透明质酸酶抑制率计算公式为:

透明质酸酶抑制率(%)=［(a－b)－(c－d)］/(a－b)×100 式(2)

其中，a为透明质酸酶+样品+透明质酸酶钾的吸光度值，b为醋酸缓冲液+样品+醋酸缓冲液的吸光度值，c为透明质酸酶+蒸馏水+透明质酸酶钾的吸光度值，d为醋酸缓冲液+蒸馏水+醋酸缓冲液的吸光度值。

1.2.6 数据分析 所有实验均至少重复三次，结果以“平均值±标准偏差”表示。利用 Excel和SPSS 16.0软件对获得的数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

乙醇体积分数对cAMP提取率的影响如图1(a)所示。该图表明，在0～60%范围内，cAMP提取率随着乙醇体积分数的增大而增加，但当乙醇体积分数大于60%时，提取率不但没有增加，反而有所下降。王立霞［12］等人也得出类似结论。这可能是由于在某一特定浓度下，cAMP分子与乙醇分子间相互吸引力最大，排斥力最小;当乙醇浓度继续增加时，cAMP溶解处于过饱和状态，有少量分子结晶析出而使溶解度下降。选乙醇体积分数45%、60%和75%作为正交实验的一组因素。

料液比对cAMP提取率的影响如图1(b)所示。如图所示，cAMP提取率随料液比从1∶5到1∶30逐渐增大。料液比在1∶5至1∶20范围内，cAMP提取率增长明显;而当料液比继续增加时，提取率增长则十分缓慢。选料液比1∶10、1∶15 和1∶20 作为正交实验的一组因素。

提取时间对cAMP提取率的影响如图1(c)所示。由该图可以看出，cAMP提取率在提取时间0～40s范围内逐渐增大;在40s后，提取率增加趋于平缓。出于节约能源与提高效率的考虑，40s即可定为最佳提取时间。选提取时间20、40、60s作为正交实验的一组因素。

提取次数对cAMP提取率的影响如图1(d)所示。由该图可以看出，cAMP提取率随着提取次数的增加而逐渐提高，但增加趋势不明显。当提取次数为4次时，提取率仅比提取3次时高1.6μg/g。综合考虑，选择提取次数1，2，3三个水平作为正交实验的一组因素。

2.2 正交实验结果及最优提取工艺

提取大枣中cAMP的正交实验按L9(34)的正交实验表进行，共9组，其结果见表2，方差分析见表3。从表2实验结果及极差分析可以看出:极差大小依次为RA＞RC＞RB＞RD，四个因素对cAMP提取率影响的主次顺序是A＞C＞B＞D，大枣cAMP的最佳提取工艺为A2B2C2D3，即60%乙醇、料液比1∶20、提取时间40s和提取次数3次。表3方差分析表明，乙醇体积分数、料液比对cAMP提取率的影响极显著，提取时间对cAMP提取率的影响显著，而提取次数对cAMP提取率的影响不显著。

图1 单因素实验结果Fig.1 The results of single factor experiments

对优化提取工艺条件(60%乙醇、料液比1∶20、提取次数3次、提取时间40s)进行验证实验，重复三次，此条件下cAMP的提取率为(149.5±3.6)μg/g。

2.3 纯化结果

2.3.1 泄露曲线 图2为cAMP提取液泄露曲线，从图中可以看出，当收集流份数大于9时，cAMP含量明显升高，故确定其为漏点。因此对于D101型大孔吸附树脂来说，20μg/mL的cAMP提取液最大上样体积为70mL。

2.3.2 洗脱流速的影响 图3显示出洗脱液流速对cAMP纯化结果的影响。从图3(a)中可以看到，洗脱流速为0.5BV/h时洗脱时间最长，而与其他两个流速相对应的洗脱时间基本相等;从图3(b)中可以看到，树脂中cAMP提取物在洗脱流速为1BV/h洗脱效果最好。综合考虑，选择1BV/h作为洗脱流速。

表2 正交实验结果表Table 2 Result of the orthogonal experiment

表3 正交实验方差分析Table 3 Analysis of variance of the orthogonal experiment

图2 cAMP提取液泄露曲线Fig.2 The leaking curve of cAMP extracts

2.3.3 乙醇浓度的影响 图4显示出洗脱液浓度对cAMP提取物纯化结果的影响。由图可知，在20%～40%范围内，乙醇浓度越大，洗脱液中cAMP含量越高，分离效果越明显。而乙醇浓度高于40%时，洗脱液中cAMP的含量有所下降，洗脱效果变差。这可能是由于乙醇为介于极性和非极性之间的溶剂［13］，当乙醇浓度增大到一定程度时，越来越多的羟基与H2O形成氢键，导致溶液极性增大，不利于cAMP这种弱极性物质的洗脱。由此可知，乙醇浓度为40%时分离纯化效果最佳。

图3 洗脱液流速的影响Fig.3 Effect of the elution rate

图4 乙醇浓度的影响Fig.4 Effect of the ethanol concentration

2.3.4 纯化结果 依照上述确定的cAMP最优纯化条件，将20μg/mL的大枣 cAMP提取液70mL，上样于D101型大孔树脂，控制流速1.5BV/h;上样完毕后，用40%乙醇以1BV/h流速洗脱180min。将洗脱液真空冷冻干燥，最终可获得纯度为68.5% ±3.4%的cAMP提取物样品。与王荔［14］等人的研究相比，此纯化方法可得到纯度更高的cAMP提取物，为将来的实际应用奠定了基础。

2.4 抗过敏实验结果

对1.2.4中纯化得到的cAMP提取物进行透明质酸酶抑制实验，结果如图5所示。

图5表明，cAMP提取物对透明质酸酶活性的抑制随前者浓度的提高而逐渐增大，最大抑制率达96.2% ±4.1%。用SPSS Statistic软件分析数据，建立回归方程:y=－2.156x2+26.667x+19.716，R2=0.9871，回归方程p＜0.01。此方程可靠性较高，计算透明质酸酶抑制率为50%时所需的cAMP提取物质量浓度IC50=0.91mg/mL。大枣cAMP的抗过敏活性检测结果与黄皮叶不同溶剂提取物［15］的抗过敏相比还要高，说明cAMP也是一种具有较强抗过敏活性的天然物质，具有很好的应用前景。

图5 cAMP提取物对透明质酸酶活性的抑制作用Fig.5 The inhibitory effect of cAMP extracts on the activity of hyaluronidase

3 结论

本研究通过单因素和正交实验获得了应用闪提法获取大枣中cAMP的最优工艺:以60%乙醇为溶剂，料液比1∶20，提取3次，每次提取40s，在该工艺条件下 cAMP提取率达(149.5±3.6)μg/g。利用D101型大孔树脂纯化cAMP提取物的结果表明:20μg/mL cAMP提取液以1.5BV/h流速上样70mL，用40%乙醇以1BV/h流速洗脱，此手段纯化cAMP提取物纯度可达68.5%±3.4%。

利用Elson－Morgan法对纯化后的cAMP提取物进行抗过敏性测定，其透明质酸酶抑制率最大可达96.2% ±4.1%，显示出良好的抗过敏活性，说明具有潜在的功能应用价值。

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