榛子叶中黄酮类化合物微波提取及纯化的研究

赵明慧，姜子涛，李 荣

(天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134)

榛子叶为桦木科(Betulaceae)榛属植物榛(Corylus heterophylla)的叶子，原产于我国，据考证迄今已有6000多年的历史。我国榛的野生资源丰富，其中以平榛(Corylus heterophylla Fisch)分布较多而且普遍，在东北、华北、陕西、甘肃、山东、河南等地均有分布。榛具有广泛的药用价值，榛的果实可用于调中、开胃、明目，榛的雄花具有消炎、消肿、止痛等功效［1－2］。榛子叶中含有较丰富的黄酮类化合物，薛建飞［2］从平榛叶中分离鉴定出了山奈酚、山奈酚－3－O－β－D－吡喃葡萄糖苷等九种黄酮类化合物;Amaral等［3］利用 HPLC/DAD/ESI－MS/MS 法，从生长在葡萄牙的欧榛(Corylus avellana L.)叶中鉴定出了槲皮素－3－鼠李糖苷、山奈酚－3－鼠李糖苷等八种黄酮类化合物，但关于榛子叶黄酮提取和分离纯化的研究尚未见报道。大孔树脂由于其本身较大的比表面积和很好的网状结构，与其他方法相比，具有吸附速率快、吸附性能好、生产周期短、可再生重复使用等优点，已在食品、环保、医药等领域得到了广泛的应用［4－5］。本文旨在研究大孔吸附树脂分离纯化榛子叶中黄酮类化合物的工艺条件，从而为综合开发和利用我国榛子叶资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

榛子叶 采自天津蓟县;AB－8、D101、D4020、NKA－9、ADS－17、ADS－21、ADS－7 和 S－8 八种大孔吸附树脂 南开大学化工厂;芦丁标准品(分析纯)北京化学试剂公司;甲醇(色谱纯)天津市科密欧化学试剂有限公司;水 娃哈哈饮用纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司出品;其余试剂均为分析纯。

U－3900紫外可见分光光度计 日本 Hitachi High－Technologies Corporation;MAS－1 微波快速制样系统 上海新仪微波化学科技有限公司;722N可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;RE－52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;LGJ－10冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司;WE－3水浴恒温振荡器 天津市欧诺仪器仪表有限公司;高效液相色谱仪 Agilent 1100 Series;色谱柱 Agilent Zorbax SB－C18(250 × 4.6mm，5μm)。

1.2 实验方法

1.2.1 微波辅助提取榛子叶粗黄酮 参照文献的方法并适当改进［6］，具体为:将榛子叶洗净烘干粉碎后，过80目筛。称取5.0g榛子叶的干燥粉末，用55%(V/V)的乙醇溶液为溶剂，在料液比为1∶35(g∶mL)，微波温度80℃、微波功率300W的条件下，微波萃取5min。提取液经滤纸自然过滤、石油醚萃取三次，去掉石油醚层，再于旋转蒸发仪中40～50℃减压旋转蒸发除去乙醇后，得到浓缩液，冷冻干燥后得到榛子叶粗黄酮的干燥粉末。

1.2.2 黄酮得率的测定 采用NaNO2－Al(NO3)3比色法［7－8］，得到芦丁标准品浓度C与吸光度A关系的线性回归方程:A=13.10857C－0.00205(相关系数R2=0.999)。并按照公式(1)计算总黄酮得率。

式中:C为由回归方程计算的样品液总黄酮浓度(mg/mL);V提取液体积(mL);N为稀释倍数;W为榛子叶粉末质量(g)。

1.2.3 榛子叶黄酮样品液的制备 准确称取0.2500g榛子叶粗黄酮粉末，用蒸馏水溶解、定容至250mL容量瓶中，即得浓度为1.0mg/mL的榛子叶粗黄酮储备液，作为样品液备用。

1.2.4 大孔吸附树脂的预处理 参照文献的方法［9］，将八种大孔树脂用95%的乙醇溶液充分浸泡24h后，用蒸馏水洗至无乙醇味。然后用5%的HCl溶液浸泡3h，用蒸馏水洗至 pH为中性。再用5%的NaOH溶液浸泡3h，用蒸馏水洗至pH为中性，最后用蒸馏水浸泡备用。

1.2.5 大孔树脂的筛选——静态法

1.2.5.1 大孔树脂的静态吸附与解析性能 准确称取处理后的八种大孔树脂各1.00g于50mL的具塞三角瓶中，分别加入20.0mL浓度为1.0mg/mL的样品液，在室温下水浴振荡24h(频率为130r/min)，待树脂充分吸附后，分别测定八种大孔树脂吸附后的上清液的吸光度值，并按公式(2)计算各树脂对榛子叶粗黄酮的吸附率。

将上述吸附且用水洗净后的八种大孔树脂分别用20.0mL 70%的乙醇溶液浸泡，在室温下水浴振荡12h(频率为130r/min)，分别测定八种大孔树脂解吸液的吸光度值，并按公式(3)计算各树脂的解吸率。

式中:A0为样品液在328nm的吸光度;Ae为吸附后上清液在328nm的吸光度;Ad为解吸液在328nm的吸光度。

1.2.5.2 大孔树脂静态吸附动力学曲线的测定 在装有2.00g D101型大孔树脂的具塞三角瓶中加入40.0mL浓度为1.0mg/mL的样品液，于室温下水浴振荡，每隔15min测定一次上清液的吸光度，并按公式(4)计算树脂的吸附量，绘制D101型大孔树脂的静态吸附动力学曲线。

式中:A0为样品液在328nm的吸光度;Ae为吸附后上清液在328nm的吸光度;C0为样品液浓度(mg/mL);V为样品液体积(mL);W为树脂质量(g)。

1.2.6 榛子叶黄酮纯化条件的确定——动态法

1.2.6.1 样品液流速的确定 准确称取1.2.4方法处理后的D101型大孔树脂6.00g，采用湿法装柱的方法装入玻璃层析柱中，分别将浓度为1.0mg/mL的样品液以1、2、3BV/h的流速加入到树脂柱中，每隔4.0mL收集一次流出液，并测定其吸光度，以泄漏点出现最迟为最佳(泄漏点指该处黄酮流出液的吸光度为样品液吸光度的1/10)，研究不同样品液流速对树脂吸附效果的影响。

1.2.6.2 样品液pH的确定 将浓度为1.0mg/mL，pH分别为2、4、6的样品液以2BV/h的流速加入到树脂柱中，每隔4.0mL收集一次流出液，并测定其吸光度，以泄漏点最迟为最佳，研究不同样品液pH对树脂吸附效果的影响。

1.2.6.3 解吸液pH和解吸液体积的确定 将浓度为1.0mg/mL、pH=4的样品液以2BV/h的流速加入树脂柱中，待吸附达到泄漏点后停止加样。分别用pH为2、4、6的70%乙醇溶液以2BV/h的流速进行解吸，每隔4.0mL(0.5BV)收集一次流出液，并测定其吸光度，绘制解吸曲线。同时收集不同pH下的解吸液，按公式(5)计算解吸率。

式中:C0为样品液浓度(mg/mL);V为样品液体积(mL);Q为静态吸附量(mg/g);W为树脂质量(g)。

1.2.6.4 解吸液乙醇浓度的确定 将浓度为1.0mg/mL、pH=4的样品液以2BV/h的流速加入树脂柱，待吸附达到泄漏点后停止加样。分别用不同浓度pH4的乙醇溶液以2BV/h的流速进行解吸，收集60%、70%和80%乙醇浓度的解吸液，将解洗液稀释5倍，分别扫描不同乙醇浓度解吸液在200～500nm波长范围内的吸收光谱，研究乙醇浓度对解吸效果的影响。

1.2.7 大孔树脂纯化效果的检验——HPLC法 根据1.2.6方法确定的最佳条件纯化榛子叶粗黄酮，将收集的纯化液旋转蒸发除去乙醇后，冷冻干燥得到纯化后的榛子叶黄酮粉末。分别用30%的甲醇溶液配制1.0mg/mL纯化前和纯化后的黄酮溶液，在相同的梯度条件下用HPLC进行检测。HPLC流动相为甲醇(A)、水(B)和5%乙酸水溶液(C)，流速为0.8mL/min，进样量为5μL;梯度条件为0～5min:30%～45%A;5～25min:45%～80%A;5%乙酸水溶液(C)一直保持10%。检测波长为270nm。

2 结果与讨论

2.1 微波辅助提取榛子叶黄酮最佳提取条件的确定

2.1.1 乙醇浓度的确定 根据方法1.2.1，在其他提取条件不变的情况下，考察不同乙醇浓度对黄酮得率的影响，结果如图1所示。

图1 乙醇浓度对榛子叶黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on flavonoids extraction

由图1可知，随着乙醇浓度的增加，黄酮的得率先增大再减小，乙醇溶液的浓度为55%(V/V)时得率最高。这是因为，黄酮由于分子上带有酚羟基和糖苷链而具有一定的极性和亲水性，根据“相似相溶”原理，黄酮易溶于中极性和极性偏强的溶剂中，但当乙醇浓度超过55%时，溶剂极性相对偏低，并且乙醇浓度过高会促使细胞内的蛋白质凝固，不利于黄酮溶出［10］。

2.1.2 料液比的确定 根据方法1.2.1，在其他提取条件不变的情况下，考察不同料液比对黄酮得率的影响，结果如图2所示。

图2 料液比对榛子叶黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on flavonoids extraction

由图2可知，随着料液比的增加，黄酮的得率先增大再减小。这是因为料液比的增加有利于黄酮的溶出，但如果料液比过大，会影响到物料对微波能量的吸收，导致黄酮得率下降。图2表明料液比为1∶35(g∶mL)时黄酮得率最高。

2.1.3 微波提取温度的确定 根据方法1.2.1，在其他提取条件不变的情况下，考察不同微波温度对黄酮得率的影响，结果如图3所示。

图3 微波温度对榛子叶黄酮得率的影响Fig.3 Effect of temperature on flavonoids extraction

由图3可知，随着微波温度的升高，黄酮得率先增大再减小，温度为80℃时得率最高。这是因为，随着温度的升高，黄酮在乙醇中的溶解度会增大，但温度过高会破坏甚至溶解黄酮分子。

2.1.4 微波功率和时间的确定 根据方法1.2.1，在其他提取条件不变的情况下，考察不同微波功率和时间对黄酮得率的影响，结果如图4所示。

图4 微波功率和时间对黄酮得率的影响Fig.4 Effect of the microwave power and extract time on flavonoids extraction

由图4可知，在相同的微波功率下，黄酮的得率随着时间的增加先增大后减小，这是因为加热时间过短，黄酮未能完全溶出;而加热时间过长会使黄酮分解，不利于黄酮的提取。此外，微波功率过大，黄酮吸收的能量过多，温度剧烈增大，会促使黄酮分解。根据实验结果选择微波功率为300W，微波时间为5min。

2.2 大孔吸附树脂的筛选

2.2.1 大孔树脂的静态吸附与解吸性能的比较 根据方法1.2.5.1，共考察了八种大孔树脂对榛子叶黄酮的吸附性能和解吸性能，结果如表1所示:

不同类型的大孔树脂因其化学结构不同，对黄酮的吸附能力也有所差别。理论上，不同类型的大孔树脂对物质的吸附能力主要取决于树脂的极性、比表面积和孔径大小等因素［11］。从表1可以看出，解吸率最高的D101型树脂的比表面积高于其它型号的树脂且平均孔径较大，与理论相符。尽管D101型大孔树脂的吸附率略低于 ADS－7、S－8和ADS－21，但考虑吸附率和解吸率两方面因素，选用D101型大孔树脂对榛子叶粗黄酮进行分离纯化。

表1 八种大孔树脂的吸附率与解吸率Table 1 The adsorption and desorption ratios of different macroporous resins

2.2.2 大孔树脂静态吸附动力学曲线 大孔树脂是一种新型的纯化材料，可大大缩短生产周期，提高生产率［12］。根据方法1.2.5.2，得到D101型大孔树脂静态吸附动力学曲线，结果如图5所示。

图5 D101大孔树脂的静态吸附动力学曲线Fig.5 Kinetic curve of static adsorption of D101 resin

由图5可知，在开始的15min内，树脂的吸附量快速增大，在15～90min内，树脂吸附量增加的速度变慢，当吸附时间达到90min以后，树脂的吸附量基本保持不变，树脂接近饱和。这说明D101大孔树脂对榛子叶黄酮的吸附为快速平衡型，与理论相符。此时根据公式(4)计算得到D101型大孔树脂对榛子叶中黄酮类化合物的最大吸附容量为16.8mg/g。

2.3 榛子叶黄酮纯化条件的确定——动态法

2.3.1 样品液流速对大孔树脂吸附的影响 样品液流速是影响树脂吸附效果的主要因素之一。根据方法1.2.6.1，得到样品液流速与大孔树脂吸附效果之间的关系，结果如图6所示。

由图6可知，样品液流速为1BV/h和2BV/h时，泄露点出现较晚，分别在33mL和31mL。而流速为3BV/h时，泄露点出现最早为26mL。这是因为样品液流速过快会影响到黄酮分子与大孔树脂的吸附作用，黄酮分子在树脂表面附着较多未能完全扩散到树脂孔内，极易随样品液流出，从而使树脂的吸附能力下降;如果流速过小，树脂的吸附时间过长［13］。因此，综合考虑树脂的吸附能力和吸附时间，选择样品液流速为2BV/h。

图6 样品液流速对D101树脂吸附效果的影响Fig.6 The effect of adsorption velocity on the adsorption efficiency of D101 resin

2.3.2 样品液pH对大孔树脂吸附的影响 样品液pH是影响大孔树脂分离纯化效果的重要因素。根据方法1.2.6.2，得到样品液pH与大孔树脂吸附效果之间的关系，结果如图7所示。

图7 样品液pH对D101树脂吸附效果的影响Fig.7 The effect of pH on the adsorption efficiency of D101 resin

由图7可知，D101大孔树脂在样品液pH为4时的吸附能力最强，随着pH的增大和减小都不利于其对黄酮类化合物进行吸附。这是因为黄酮类化合物因其结构上具有酚羟基而带有一定的酸性，并且黄酮类化合物的酸性大小与酚羟基的位置和数目有关［14］。在弱酸性条件下黄酮能以分子形式存在，与树脂产生范德华力而被吸附;如果酸性过强，黄酮会与溶液中的氢离子结合形成佯盐［15］，黄酮主要以离子形式存在，从而不利于大孔树脂的吸附。所以最终确定样品液pH 4为宜。

2.3.3 解吸液pH和解吸液体积对大孔树脂解吸的影响 根据方法1.2.6.3，得到不同pH解吸液的解吸曲线和解吸率，如图8、图9所示。

图8 不同pH解吸液的解吸曲线Fig.8 The desorption curve of different pH

图9 不同pH解吸液的解吸率Fig.9 The desorption rates at different pH values

由图8、图9可知，当pH为4时，解吸曲线峰型最高且无拖尾现象，解吸率最高为96.8%;pH为2时，黄酮的解吸率最低，同时反映到解吸曲线上表现为解吸峰型最低。并且，从图8可以看出，pH为2、4、6时解吸液体积均为3BV，故应选择pH为4的3BV乙醇溶液为解吸液。

2.3.4 解吸液乙醇浓度对大孔树脂解吸的影响 根据方法1.2.6.4，得到不同乙醇浓度解吸液的紫外吸收曲线，如图10所示。

图10 不同乙醇浓度解吸液的紫外吸收曲线Fig.10 The UV absorption of different concentrations of eluate

由图10可知，当乙醇浓度为70%时，解吸出的黄酮最多，且解吸液的整体峰型与样品液相比基本没有发生变化。这是因为，大孔树脂分离纯化的原理是依据被吸附物质和树脂的极性来决定的。因此，解吸液乙醇浓度的大小应根据黄酮和树脂之间的吸附力来决定。故选择最佳的解吸乙醇浓度为70%。

2.4 大孔树脂纯化效果的分析

根据方法1.2.7，得到D101型大孔树脂纯化前后榛子叶黄酮在270nm下的高效液相色谱图，结果如图11所示。

图11 D101大孔树脂处理前后270nm下榛子叶黄酮的HPLC图Fig.11 HPLC profile of the flavonoids of the Corylus heterophylla leaves monitored at 270 nm by D101 resin

通过图11可以看出，经D101大孔树脂纯化后的榛子叶黄酮色谱峰响应值比相同浓度纯化前的略有增加，且10.000、12.544、13.057min 处，纯化后色谱峰的响应值增加了1.6、1.3、1.5倍;同时，对比纯化前后的HPLC图还可发现，2.969min处纯化前没有分开的山包状色谱峰在纯化后变为了两个明显分开、形状尖锐的色谱峰;7.501min处纯化前的杂质峰在纯化后已经没有。这表明D101大孔树脂对榛子叶黄酮起到了纯化作用。

3 结论

利用单因素实验对微波辅助法提取榛子叶黄酮的主要因素进行了研究，确定了最佳提取条件是:乙醇浓度为 55%(V/V)，料液比为 1∶35(g∶mL)，微波温度80℃，微波功率300W，提取时间5min。

本实验通过静态吸附和解吸实验，从八种大孔树脂中筛选出了比较适合用于纯化榛子叶中黄酮类化合物的树脂类型，确定了D101型大孔树脂是分离纯化榛子叶黄酮的最佳树脂，其不仅具有较高的解吸率，而且吸附速率快、生产效率高;同时，通过动态实验确定了D101型大孔树脂纯化榛子叶黄酮的最佳工艺参数为:样品液流速为2BV/h、样品液pH4、解吸液pH4，解吸液乙醇浓度为70%。HPLC分析结果证明:该方法用于纯化榛子叶黄酮具有可行性，经纯化后的榛子叶黄酮含量提升至54.7%。

本研究初步建立了微波法提取榛子叶黄酮和大孔树脂纯化榛子叶黄酮的工艺参数，为榛子叶资源量为75.9%，高出国标要求10.9%，其余指标也均基本符合国家标准要求。

表6 果胶质量指标测定结果Table 6 The results of pectin quality index determination

3 结论

实验结果表明可以实现苹果皮中多酚和果胶的连续化生产，确定了苹果皮渣多酚超声辅助提取的回归数学模型，最优提取工艺条件:料液比1∶20(g/mL)，提取温度63℃，提取液乙醇浓度60%，提取时间为58min，此条件下多酚的提取量高达18.29mg/g，多酚纯度达到52.56%;并且确定了离子交换树脂辅助酸解法提取苹果皮果胶的最佳条件:树脂用量为11%，pH为1.3，提取时间2.0h，提取温度75℃，料液比1∶24(g/mL)，此条件下果胶得率高达26.26%，此得率比大部分同类研究的结果高出很多。说明从苹果皮中连续提取和分离多酚、果胶的工艺具有良好的工业化生产潜力，应用前景广阔。

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