高压C O2对枯草芽孢杆菌杀菌模型及其优化

高 媛，周先汉，曾庆梅，吴克平，邹旭鹏

（1.宁夏大学生命科学学院，宁夏银川750021；2.合肥工业大学分析测试中心，安徽合肥230009；3.合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥230009）

高压CO2杀菌技术（High Pressure Carbon Dioxide，简称HPCD）作为一种新兴的“冷杀菌”（又称非热杀菌）技术受到广泛关注[1]。高压CO2杀菌技术在有效的杀灭微生物保证食品贮藏安全的同时，又能满足广大消费者对于食品新鲜、健康、安全的要求。和具有“冷杀菌”美誉的超高压灭菌（400～1000MPa）技术相比，高压CO2杀菌技术操作压力相对较低，一般只需3～70MPa，同时随着高压CO2的设备改进、成本降低及杀菌机理的明确，其在食品加工领域的发展前景更加广阔[2-5]。高压CO2杀菌技术已经在液体食品中取得了良好的杀灭微生物的作用。在压力低于50MPa，温度5～60℃之间进行的高压CO2处理可以实现对微生物2～12个对数级的杀灭效果[6]，至少有12种革兰氏阳性菌，10种革兰氏阴性菌，8种细菌芽孢以及8种真菌菌丝体或孢子被用来进行高压CO2处理杀菌的实验研究[7-9]，在适当的温度和压力下，单纯高压CO2处理能够显著地杀灭细菌的营养体。然而在室温下，高压CO2处理对于细菌芽孢的杀灭效果不够理想[10-13]。由于芽孢的高耐热性和其他抗性，因此，是否能够杀灭一些代表菌的芽孢就成了衡量各种消毒手段的最重要的指标。芽孢杀灭的指示菌——枯草芽孢杆菌具有芽孢结构，孢子较为耐热耐压，用高压CO2对其孢子较为难杀灭。当芽孢一旦萌发生长为营养体后，则其抗热抗压能力下降，与非芽孢菌的菌体类似，较易杀灭[14-15]。本文以枯草芽孢杆菌为研究对象，通过高压CO2处理实验，考察其在不同压力和温度组合条件下的致死作用，结合响应曲面法的Box-Behnken模式，建立枯草芽孢杆菌高压CO2杀菌模型，优化杀菌工艺参数，为高效杀灭芽孢菌奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）编号：20622，购自中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）；高压气体 实验选用高压CO2气体作为实验选用的杀菌介质，气体纯度为99%，CO2气瓶压力为5～6MPa，由合肥恒隆电气技术有限公司提供；固体培养基 普通营养琼脂（蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL），调pH7.0～7.2，121℃高压灭菌15min；促芽孢生长培养基[16]在上述固体培养基中加入MnCl2（培养基中Mn2+的浓度为50mg/L），调pH后混匀，灭菌备用；液体培养基 营养肉汤（蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL），加入3%硫酸锰溶液，混匀，121℃高压灭菌15min。

HA121-50-01-C高压CO2杀菌装置 如图1所示，最高压力50MPa，单缸容积1L，江苏南通华安超临界萃取有限公司生产；TDL-50B台式离心机 上海安亭科学仪器厂；PHS-25B型数字酸度计 上海大普仪器有限公司；721分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；净化工作台 苏州净化设备有限公司；生化培养箱 上海跃进医疗器械厂；微生物实验常规仪器。

图1 高压CO2杀菌设备工艺流程图Fig.1 Schematic diagram of high pressure CO2sterilization

1.2 实验方法

1.2.1 枯草芽孢杆菌萌发处理 为保证枯草芽孢杆菌芽孢一定的形成率，在100mL液体培养基中接入枯草芽孢杆菌，（30±1）℃、150r/min培养18h，用接种环挑取第1代的菌悬液，30℃下于固体培养基平板上划线培养18h，染色后显微镜检（芽孢专用染色法），要求芽孢形成率在90%～95%以上。4000r/min离心30min，弃上清液，加无菌蒸馏水冲洗离心，重复2～3次；将洗净的芽孢悬浮于灭过菌的磷酸钾缓冲液（PBS，0.2mol/mL，pH7.2）中，调细胞浓度为108～109CFU/mL[17]。热力和压力协同能够有效地促进芽孢的萌发，结合实验结果并考虑到具体的应用，选择协同温度60℃，压力10MPa，对芽孢悬液进行40min的高压CO2处理，促使芽孢萌发，随后验证高压CO2改变杀菌参数时的杀菌效果。

1.2.2 样品的高压CO2处理 实验前，于无菌操作台上，将制好的枯草芽孢杆菌孢子悬液接种于pH为7.2的磷酸盐缓冲液中，并调整含菌量为107CFU/mL。将菌悬液加入釜内，通入CO2先赶走釜内残存的空气，然后向高压釜内通入CO2至所需压力（升压时间控制在30s左右），按照实验要求保压一定时间后，从放料口出料。

1.2.3 微生物数量的测定 采用平板计数法（GB 4789-2003）进行菌落计数，以无菌生理盐水适当稀释处理后和未处理（对照组）的芽孢菌悬液，于营养琼脂平板上37℃培养48h后，计菌落数。重复3次，计平均数。

式中：N—经过高压CO2处理后，芽孢在普通营养琼脂培养基上培养可见的菌落总数，CFU/mL；N0—未经过高压CO2处理前的菌落总数，CFU/mL。

1.2.4 高压CO2致死枯草芽孢杆菌的响应曲面法分析 采用Box-Behnken模式，以萌发后的枯草芽孢杆菌为实验对象，以压力、温度和保压时间为自变量（independent variable），实验优化，建立高压CO2杀灭枯草芽孢杆菌杀菌效果模型。

结合现有实验条件及相关研究报道[17]，确定压力、温度和保压时间三个因子的取值范围分别为10～30（步长10）MPa、10～50（步长20）℃和30～90（步长30）min。根据xi（Xi-Xi0）/ΔXi对自变量进行编码（xi为自变量的编码值；Xi为自变量的真实值，其中i=1，2，3；Xi0为实验中心点处自变量的真实值；ΔXi为自变量变化步长）。实验自变量因素编码及水平见表1。高压CO2对枯草芽孢杆菌的杀灭对数值Y（致死率）为响应值（Y=-lgNi/N0，其中Ni为高压CO2处理后1mL菌液中活菌数，N0为未处理的对照组1mL菌液中的活菌数）。采用Design Expert 7.1.0软件进行实验设计和数据分析。

表1 实验自变量因素编码及水平Table 1 Codes and levels of factors chosen for the trials

2 结果与讨论

2.1 高压CO2致死枯草芽孢杆菌回归模型的建立

采用统计软件Design-Expert 7.0进行实验设计，并优化出17组实验，实验结果见表2。为了确保实验结果的科学性，随机挑选表2中的组别进行实验，不刻意按照其实验号顺序进行实验。通过回归分析得到多元二次回归模型：

对模型进行方差分析，结果见表3。由表中可以看出：模型F模型=127.87＞F0.01（9，4）=14.66，模型p＜0.0001，表明模型极显著，F失拟=2.74＜F0.05（9，3）=8.81，失拟项p=0.1772＞0.05，模型失拟度不显著。模型的调整确定系数R2Adj=0.9862，说明该模型能够解释98.62%响应值的变化，因而模型拟合程度良好，实验误差小，可以用此模型对高压CO2杀灭枯草芽孢杆菌进行分析和预测。

表2 实验设计与结果Table 2 Box-Behnken experimental design arrangement and responses

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for regression equation

回归方程系数显著性检验结果见表4。由表4可知，模型中检验项p值小于0.0500，则该项显著，否则该项不显著。模型中一次项压力X1、温度X2、时间X3、二次项达到极显著水平（p＜0.0001）、X1X2达到显著水平（p＜0.05）；（p=0.0819）、交互项X1X3（p=0.1241）、X2X3（p=0.6059）不显著。

其中自变量X2X3影响不显著（p＞0.25），进行回归方程的优化，剔除不显著的影响因素X2X3，重新进行回归分析，剔除后的方差分析见表5。

方差分析表明，各因素对致死率的影响大小顺序为：X2＞X1＞X3；剔除不显著系数后，除交互项X1X2（p=0.1241）以及二次项（p=0.1772）不显著，各因素回归系数达到显著水平，新的回归方程为：

表4 回归方程系数显著性检验Table 4 Test of significance for regression coefficients

表5 偏回归系数检验方差分析表Table 5 Test of significance for regression coefficients

2.2 压力与温度因素对枯草芽孢杆菌致死率的响应曲面

图2 Y=f（X1，X2）的响应面Fig.2 Response surface of Y=f（X1，X2）

图2为X3=0水平（保压时间60min）时，压力与温度两因素的响应曲面。在压力（X1）为10～30MPa，温度（X2）10～50℃的响应曲面中可以看到：在压力固定不变的情况下，随着温度的增加，枯草芽孢杆菌致死率有显著的提高。在温度固定不变的情况下，随着压力的增加，致死率有所增加，但增加的幅度较小。

2.3 压力与时间因素对枯草芽孢杆菌致死率的响应曲面

图3为固定温度X2=30℃条件下在不同压力和时间处理下枯草芽孢杆菌致死率变化情况。由回归方程系数显著性检验可知，压力（p＜0.001）和时间（p＜0.001）都是枯草芽孢杆菌致死的显著影响因素，两者交互作用不显著。从压力和时间因素的响应曲面图中可以看出，在时间固定不变的情况下，随着压力的增加，致死率增加；在压力固定不变时，延长保压时间可以缓慢增加枯草芽孢杆菌的致死率。

图3 Y=f（X1，X3）的响应曲面Fig.3 Response surface of Y=f（X1，X3）

2.4 温度与时间因素对枯草芽孢杆菌致死率的响应曲面

图4 Y=f（X2，X3）的响应曲面Fig.4 Response surface of Y=f（X2，X3）

图4为X1=0水平时，即固定压力为20MPa的条件下，温度与时间对枯草芽孢杆菌致死率的影响。在温度（X2）为10～50（步长为10）℃，保压时间（X3）为30～90（步长为15）min变化的响应曲面图中可以看到：在压力处于20MPa水平下，时间固定不变的情况下，随着温度的增加，致死率不断提高；而当温度固定不变时，随着温度的增加致死率提高的很缓慢。温度与时间因素处于最高水平时能够达到4.7个对数值的杀菌率。要想提高杀灭效果,必须提高温度。

2.5 高压CO2杀菌最佳条件的优化

考虑到高压CO2在食品工业中的实际应用，由式（2）回归方程预测杀灭枯草芽孢杆菌的最佳条件。采用统计软件Design Expert软件模拟寻优预测出10组杀菌效果好的工艺参数进行验证，表中所列各参数值为控制目标值，波动范围分别为压力±2MPa，温度±1℃，时间±1min。结果见表6。

由表6可以看出，回归模型预测优化出的10组杀灭效果较好的工艺参数其杀灭效果预测值最高能够达到5.44个数量级，最低4.82个数量级。工艺参数的取值范围是：压力X1为22.55～30.00MPa，温度X2为37.17～50℃，时间X3为36.42～90min。考虑到最大限度的保留食品的营养和风味，节约能源，将高压CO2杀灭枯草芽孢杆菌的杀菌优化工艺参数确定为：压力30MPa，温度48℃，时间90min。验证实验测得的枯草芽孢杆菌杀灭对数值为5.22，与模型预测值相差4.04%。实验平均相对误差为2.32%；因此，采用响应曲面优化法建立的回归模型准确可行，优化得到的工艺参数可以应用。

表6 回归模型优化的10组杀菌工艺参数及结果验证Table 6 Verified results of sterilized process parameters of optimum ten groups from regression equation

3 结论

以枯草芽孢杆菌为主要研究对象，采用响应曲面法中的Box-Behnken设计，进行了对已部分萌发枯草芽孢杆菌的高压CO2杀灭效果优化实验，结果表明，各因素对杀灭效果的影响大小顺序为温度（X2）＞压力（X1）＞时间（X3）。对杀菌对数值的响应变化进行建模分析，建立了杀菌效果模型，在实验条件范围内建立的的回归模型准确有效，可以用于预测实验条件范围内的杀灭对数值，可为杀菌工艺参数的选择提供参考。通过对所建立的回归模型优化得出的10组实验条件进行验证，在压力30MPa，温度48℃，时间90min的条件下进行高压CO2处理，达到5.22个杀灭对数值的效果，与模型预测值相差4.04%。

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