低温贮藏和短波紫外线辐照对芥蓝采后叶绿素降解及脱镁叶绿素酶活性的影响

刘 振，唐 蕾，*，王海鸥，毛忠贵，张 玲，王 武

(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122;2.江南大学食品学院，江苏无锡，214122)

绿叶蔬菜采后失绿直接影响产品感官品质和货架寿命。失绿源于叶绿素降解。叶绿素是含镁的卟啉类光合色素，在高等植物中分为叶绿素a和叶绿素b。目前认为叶绿素降解始于叶绿素a，叶绿素b转化为叶绿素a后，先脱去卟啉环中鳌合的镁生成脱镁叶绿素a，再经脱镁叶绿素酶(PPH)的作用生成脱镁叶绿酸a，然后由脱镁叶绿酸a单加氧酶(PaO)催化卟啉环的开环［1］。由此可见，在叶绿素降解过程中酶的作用至关重要。所以研究采后处理与贮藏条件对叶绿素降解相关酶活性的影响，进而控制叶菜采后失绿，提高品质、延长货架期具有实用价值。然而目前相关方面的理论研究尚十分有限。芥蓝(Brassica alboglabra L.)是我国南方特有的蔬菜品种之一，因其质脆、清鲜、营养丰富深受广大消费者喜爱，并且远销东南亚等国家和地区［2－3］。作为鲜食蔬菜，采后护绿是芥蓝保鲜的一个重要方面。对于需要较长时间贮运且保持良好品质的芥蓝，如出口销售芥蓝，低温是常用的保鲜方法。短波紫外线(UV－C)辐照作为一种安全、无污染的绿色环保保鲜方式，近年来受到广泛关注。通过使用适宜的紫外线辐照果蔬，可以影响其多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、抗氧化酶等的表达［4］。上述两种方法对芥蓝贮藏过程中叶绿素及其相关降解酶类的影响尚未见报道。为此本文进行了温度以及UV－C辐照对贮藏过程中叶绿素含量及PPH活性变化的影响，试图为控制芥蓝采后失绿提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芥蓝叶片 市购芥蓝，清水洗净，吸干表面水分，选取饱满嫩绿，新鲜度大小基本一致，无病虫害，无机械损伤的叶片;叶绿素a 购自美国Sigma公司，经酸化处理为脱镁叶绿素a;BCA蛋白质浓度测定试剂盒 购自上海生工生物工程有限公司;其他试剂 购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

冷冻离心机 美国Sigma公司;Unico UV－2100紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司;光照培养箱 韶关市泰宏医疗器械有限公司;紫外灯(15w，254 nm)佛山电器照明股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 叶绿素含量的测定 取0.2g芥蓝叶片，加液氮研成粉末，转入15mL带塞离心管中，加80%的丙酮水溶液，避光浸提，5000r/min离心10min，吸取上清液稀释一倍后测定645及663nm处的吸光值，按照Aron公式计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量［5］。

1.2.2 PPH活力的测定方法 参照Aiamla－or等的方法并予以改进［6］。

丙酮粉制备:取10g叶片，加入冷丙酮(－20℃)匀浆，滤纸抽滤，冷丙酮洗滤，室温干燥，－20℃贮藏备用。

酶液制备:取上述丙酮粉 0.5g，加入 25mL 50mmol/L的Tris－HCl(pH8.0)，冰浴搅拌1h后用2层纱布过滤，滤液在4℃下10000r/min离心15min。上清液用45%～80%饱和硫酸铵沉淀，沉淀用缓冲液溶解，置于4℃备用。

PPH活性测定:反应混合液由0.35mL酶液，75μL 2.0% Triton X－100，0.1mL 脱镁叶绿素 a(10μmol/L)，0.7ml 50mmol/L Tris－HCl(pH8.0)组成。反应于暗处25℃下进行。90min时加入丙酮至终浓度为25%终止反应。然后，加入3mL的正己烷萃取脱镁叶绿素a，于667nm测定在丙酮层中的脱镁叶绿酸a的吸光值。PPH活性以每分钟生成1μmol脱镁叶绿酸a为一个酶活单位(U)。

1.2.3 蛋白含量测定 按照“BCA蛋白质浓度测定试剂盒”(上海生工生物工程有限公司)说明书的操作测定酶液中总蛋白的含量。以牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白。

1.2.4 UV－C处理与贮藏 将芥蓝叶片置于紫外灯下分别照射 5、10、15、20min，期间翻转叶片，使叶面辐照均匀。以不照射为对照，处理完毕后，放入保鲜袋中，置于暗处22℃贮藏5d。分别在第0、1、3、5d的同一时间取样测定叶绿素含量、PPH活性。

1.2.5 数据处理 每个指标测定均重复3次，应用SPSS 13.0对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 贮藏温度对叶绿素降解的影响

2.1.1 贮藏温度对叶绿素含量的影响 温度对植物叶绿素降解有不同的影响，秋季落叶树木的绿色随温度的降低而消退，而对采后蔬菜而言，降低贮藏温度一般能使绿色稳定。然而，某些蔬菜在－18℃时仍有叶绿素降解现象发生［7］。在本实验中我们探讨了温度对贮藏过程中叶绿素a、b的影响。选取的温度为常温22℃和低温4℃。结果表明，低温贮藏的叶绿素降解速度明显低于常温贮藏(图1)。第5d较第0d，低温组叶绿素a和b的含量分别下降了9.74%和17.15%，而常温贮藏的芥蓝叶绿素a和b的含量分别下降了85.43%和93.92%。

图1 温度对芥蓝贮藏过程叶绿素含量的影响Fig.1 Effect of temperature on chlorophyll a and b contents during storage

2.1.2 贮藏温度对PPH的影响 PPH专一催化脱镁叶绿素a生成脱镁叶绿酸a［8］，为PAO的开环反应提供了唯一的底物。PPH的发现改变了以往认为:叶绿素酶是叶绿素降解的第一步的观点［9］。由于PPH较其他参与叶绿素降解的酶发现迟，对其研究尚十分有限。有研究表明在与芥蓝同属的花椰菜(Brassica oleracea L.)的采后处理中，叶绿素的降解与PPH的表达量相关［10］。为此本文研究了贮藏温度对PPH活力的影响，以第0d的PPH活力(14.5mU/g蛋白)为100%，探讨其在贮藏过程中的变化与叶绿素降解之间的关系。结果表明22℃贮藏时，PPH活性在前期快速升高，第3d时约为第0d的200%，第5d时酶活性降低，约为第0d的35%，而在4℃贮藏时，PPH活性虽然一直上升，但增速缓慢，第3d时仅为第0d的135%，并且前3d的活性始终低于22℃时的水平。因此低温贮藏可能因为抑制前期PPH活性的迅速上升，从而延缓了叶绿素的降解(图2)。

2.2 短波紫外线辐照对叶绿素降解的影响

2.2.1 辐照时间对叶绿素含量的影响 波长在200～400nm的电磁辐射称为紫外辐射，其中波长范围为200～280nm为短波紫外光UV－C。UV－C对大多数微生物具有杀灭作用，因此作为一种操作简单、无污染的杀菌方法很早即被应用于食品工业中。近年的研究表明UV－C除了杀菌之外，还可以影响到蛋白质、VC等营养物质以及抗氧化酶等酶类的表达，在提高叶菜、果蔬的贮藏期品质，延缓其后熟、衰老过程发挥积极作用［11－14］。

图2 温度对贮藏过程PPH活性变化的影响Fig.2 Effect of temperature on PPH activity during storage

在叶菜的保鲜中防止黄化，抑制叶绿素降解，是关键因素之一。为此本研究考察了UV－C处理与叶绿素含量的关系。结果表明UV－C照射能够有效延缓叶绿素含量的下降，并随着辐照时间的延长，叶绿素的降解越缓慢(图3)。该效果在贮藏前期更为显著，当辐照20min，22℃贮藏3d时，叶绿素a的含量为0.49mg/g FW，是对照的1.75倍;叶绿素b的含量为0.16mg/g FW是对照的2.14倍(图4)。

图3 UV－C辐照时间对贮藏过程叶绿素含量的影响Fig.3 Effect of UV－C irradiation time on chlorophyll content during storage

图4 UV－C辐照20min对贮藏过程叶绿素a及叶绿素b含量的影响Fig.4 Effect of 20min UV－C irradiation on chlorophyll a and b contents during storage

2.2.2 UV－C辐照对PPH活性的影响 为了进一步研究UV－C辐照减缓叶绿素降解的原因，本文对经辐照处理的芥蓝在贮藏过程中PPH活性的变化进行了研究。辐照时间为20min，贮藏温度为22℃，避光。UV－C辐照后PPH活力下降，仅为未辐照的67%。以第0d的PPH酶活为100%。结果表明与对照相比，UV－C辐照抑制了贮藏前期PPH酶活性的迅速上升，与第0d相比，未经辐照的芥蓝在第1d的PPH酶活上升了50%，而UV－C辐照处理的仅上升了14%(图5)。之后，PPH活性上升加快，第3d较第1d上升了112%，相应叶绿素降解明显，总叶绿素含量由第1d时0.97mg/g FW降至第3d的0.66mg/g FW，下降了32%(图3)。

图5 UV－C辐照20min对贮藏过程PPH酶活性变化的影响Fig.5 Effect of 20min UV－C irradiation on PPH activity during storage

叶绿素降解是一个多酶参与的生化过程，酶的表达调节在不同植品种和不同生理条件下有所不同。PPH作为一种新发现的酶，对其的研究报道还十分有限，而且结果也不尽相同。Büchert等对花椰菜采后热空气、UV－C、光照和气体成分对叶绿素降解相关酶基因表达的影响表明:热、UV－C和光照处理延缓了叶绿素降解，同时调节了PPH的表达，而气体成分虽然阻碍了叶绿素降解却未能抑制PPH的表达［15］。Aiamla－or等发现叶绿素含量的下降与 PPH的活性增加相一致，较长波长的紫外辐照(UV－B)处理有效地抑制了叶绿素的降解，PPH活性的增强在处理后的前两天略有降低，随后与对照同样上升［6］。本文的研究结果与Aiamla－or等的更为相似，具体表现在芥蓝叶绿素降解与PPH活性相关联，在常温及未经UV－C处理的芥蓝中，叶绿素在第0d到第3d内快速降解，PPH活性增加;在此之后即从第3d到第5d时，叶绿素降解减缓，PPH活性明显下降。而低温和UV－C处理抑制了PPH酶的上升速度，因而减缓了叶绿素的降解。但是，并未发现叶绿素含量与PPH酶活性之间存在定量关系，分析可能与参与叶绿素降解的其他酶有关。

3 结论

低温和UV－C辐照作为一种安全、无污染的绿色环保保鲜方式可延长蔬菜的货架寿命。本研究的结果表明上述处理方法可抑制叶绿素降解途径中PPH活性的迅速上升，从而延缓了贮藏过程中叶绿素的降解，对芥兰采后持绿方法的开发提供了一定的理论依据。

［1］唐蕾，毛忠贵.植物叶绿素降解途径及其分子调控［J］.植物生理学报，2011，47(10):936－942.

［2］La G X.，Fang P，Teng Y B，et al.Effect of CO2enrichment on the glucosinolate contents under different nitrogen levels in bolting stem of Chinese kale(Brassica alboglabra L.)［J］.Journal of Zhejiang University Science B，2009，10:454－464.

［3］王趁趁，丁超，唐蕾，等.芥蓝叶片过氧化物酶稳定性的研究［J］.食品工业科技，2012(3):310－312.

［4］赵宇瑛，柳承芳.紫外照射技术对果蔬贮藏保鲜的影响研究进展［J］.长江大学学报:自然版，2011(12):255－257.

［5］Arnon D I.Copperenzymesin isolated chloroplasts.Polyphenoloxidase in Beta vulgarts［J］.Plant Physiology，1949，24:1－5.

［6］Aiamla－ or S，Nakajima T，Shigyo M，et al.Pheophytinase activity and gene expression of chlorophyll－degrading enzymes relating to UV－B treatment in postharvest broccoli(Brassica oleracea L.Italica Group)florets［J］.Postharvest Biology and Technology，2012，63:60－66.

［7］张学杰，蔡同一，孙润峰，等.绿色蔬菜在贮藏、加工过程中绿色损失的机制、途径及其控制［J］.食品工业科技，1999，20(5):19－21.

［8］Schelbert S，Aubry S，Burla B，et al.Pheophytin pheophorbide hydrolase(Pheophytinase)is involved in chlorophyll breakdown during leaf senescence in Arabidopsis［J］.The Plant Cell，2009，21:767－785.

［9］Eckardt N A.A New Chlorophyll degradation pathway［J］.The Plant Cell，2009，21:700.

［10］Büchert A M，Civello P M，Martínez G A，et al.Chlorophyllase versus pheophytinase as candidates for chlorophyll dephytilation during senescence of broccoli［J］.Journal of plant physiology，2011，168:337－343.

［11］郭新竹，宁正祥.紫外技术在食品工业中的应用［J］.粮油加工与食品机械，2001(9):9－11.

［12］郑杨，曹敏，申琳，等.短波紫外线照射对韭菜采后贮藏品质及活性氧代谢相关酶的影响［J］.食品科学，2011，32(20):307－311.

［13］王娟，陈平生，孟祥春.复合涂膜结合紫外处理对鲜切木瓜冷藏品质的影响［J］.农业工程学报，2012，28(2):273－278.

［14］陈从贵，张景强，高慧.芹菜的鲜切加工与保鲜研究［J］.食品工业科技，2003，24(11):69－71.

［15］Büchert A M，Civello P M，Martínez G A.Effect of hot air，UV－C，white light and modified atmosphere treatments on expression of chlorophyll degrading genes in postharvest broccoli(Brassica oleracea L.)florets.Scientia Horticulturae，2011，127:214－219.