高效液相色谱法同时测定绿原酸及其五种主要代谢产物

罗晓燕，吴九九，温艳梅，阮 征，骆成尧，周 艳，蔡力创，刘文群，印遇龙

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330031；2.江西省科学院生物资源研究所，江西南昌330029；3.江西省科学院计算机信息中心，江西南昌330029）

多酚在日常食物中含量丰富，具有多种生物活性，目前对多酚的研究已成为食品和营养领域的研究热点[1-3]。绿原酸属于广泛存在于葵花籽、咖啡豆、杜仲等植物中的一类酚酸，其中在咖啡豆中的含量占了2%～8%[4-6]。Cho等[7]表明绿原酸能改善小鼠体重，调节脂肪代谢和肥胖相关的激素水平。史秀玲等[8]发现绿原酸对四氯化碳所致的小鼠肝损伤具有保护作用。Chagas-Paula等[9]表明肿柄菊中的绿原酸具有很好的抗炎效果。绿原酸在微生物作用下的代谢产物与其生物活性的发挥密切相关。研究表明，绿原酸不易被胃肠的消化液消化，在小肠的吸收率低，大部分进入结肠被微生物降解[10-12]。Gonthier等[13]通过高效液相色谱-电喷雾串联质谱法检测绿原酸在小鼠体内的代谢产物，发现其代谢物主要有咖啡酸、阿魏酸、m-香豆酸、苯甲酸、马尿酸、3-羟基苯丙酸等。Monteiro等[14]采用高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）法测定咖啡豆中绿原酸在人体内的代谢产物，主要有咖啡酸、阿魏酸、p-香豆酸、香草酸等。目前，绿原酸及其他酚酸的测定的方法主要有紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用（GC-MS）法、液相色谱-质谱联用（HPLC-MSn）法等[15-19]，分光光度法测有相同发色团的总含量，而不是单一成分的含量，有时测定结果可作参考。HPLC－MSn法虽然快速、准确，但预处理复杂，分析成本高。因此需要建立一种操作简单、准确可靠、重复性好的方法检测绿原酸及其主要代谢产物，HPLC法是一种较好的选择。本实验建立了一次性检测绿原酸及其5种主要的代谢产物（咖啡酸、阿魏酸、p－香豆酸、3－羟基苯丙酸及马尿酸）HPLC法，为绿原酸的代谢及其进一步的研究提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、p－香豆酸、3－羟基苯丙酸及马尿酸标准品 色谱纯，纯度≥98%，贵州迪大科技有限公司；水 实验室自制双蒸水；甲醇 色谱纯；冰醋酸 分析纯。

Agilent 1200高效液相色谱仪 配有紫外检测器，美国安捷伦公司；SC－3614低速离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司；AL104分析天平 梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；5418R冷冻离心机德国艾本德公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：美国Agilent Eclipse XDB－C18（250mm×4.6mm，5μm）联合Eclipse XDB－C18（20mm×4.0mm，5μm）保护柱；流动相：甲醇（A）和体积分数1%的冰醋酸水溶液（B），采用梯度洗脱程序：0～5min，A 100%～50%；5～10min，A 50%～30%；10～15min，A 30%～0%；15～17min，A 0%～100%；检测波长：0～10min，320nm；18～19min，253nm；19～24min，320nm；流速：1mL/min；柱温：25℃。

1.3 粪便悬浮液的制备

取大鼠新鲜粪便按1∶5（m/v）的比例加入生理盐水，加入玻璃珠振荡5min，让粪便与生理盐水充分混匀后用4层纱布过滤去渣，制成粪便悬浮液，然后将粪便悬浮液在121℃下高温灭菌20min，待冷却后置于4℃保存备用。

1.4 标准溶液的制备

精确称取一定量的绿原酸、咖啡酸、3－羟基苯丙酸、p－香豆酸、阿魏酸和马尿酸标准品，溶解于制备好的20mL粪便悬浮液，分别配制成浓度为450、300、100、312、100、135mg/L的混合标准溶液。根据需要将此混合标准品溶液用灭菌的粪便悬浮液逐级稀释。贮存于4℃备用。分析前，用0.45μm膜过滤。

1.5 标准曲线的绘制

以峰面积（Y）为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标，进行线性回归计算，得标准曲线回归方程。

2 结果与分析

2.1 混合标准溶液的测定

准确移取1.4配制好的混合标准溶液，稀释至一定浓度后进样20μL，在1.2的色谱条件下分析，如图1所示。绿原酸、咖啡酸、3－羟基苯丙酸、p－香豆酸、阿魏酸和马尿酸均能良好分析，且6种酚酸类物质在20min内得到了很好的分离。

图1 混合酚酸类标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of phenolic compounds solution

2.2 线性关系考察

精密量取1.4配制好的混合标准溶液，逐级稀释，每个浓度20μL进样，以峰面积（Y）为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标，绘制各标准品的标准曲线，并进行线性回归，结果见表1。由表1可见，6种酚酸的相关系数为0.9979～0.9999，检出限为0.098～0.363，说明绿原酸及其主要代谢产物在一定范围内具有良好的线性关系。

2.3 精密度实验

精确量取混合标准溶液，在1.2色谱条件下连续进样6次，每次20μL，以绿原酸、咖啡酸、p－香豆酸、3－羟基苯丙酸、阿魏酸和马尿酸的峰面积计算相对标准偏差（RSD）（n=6），6种酚酸的RSD分别为：0.58%、0.86%、0.65%、1.32%、0.93%、0.90%，表明该仪器精密度良好，具体结果见表2。

2.4 稳定性实验

精确量取预先配制好的混合标准溶液，在1.2的色谱条件下分别于0、2、4、8、12、24h各进样20μL，结果绿原酸、咖啡酸、3－羟基苯丙酸、p－香豆酸、阿魏酸和马尿酸的峰面积的RSD分别为：1.96%、1.88%、1.52%、2.07%、2.17%、0.34%，表明该样品在24h内稳定。

表1 检测方法的回归方程、相关性系数、线性范围及检出限Table 1 Regression equation，correlation coefficient，linear range and detection limit for the method

表2 6种酚酸的精密度实验结果（n=6）Table 2 The results of precision test of 6 phenolic acids（n=6）

2.5 加样回收率实验

分别取空白粪便悬浮液50mL均分9份，分别加入3组质量水平（120%、100%、80%）的6种酚酸，配制成高中低三种混合标准溶液，在1.2的色谱条件下进样20μL分析，每个样重复三次进样，测定结果见表3。由表3可知，6种酚酸的平均回收率为86.84%～101.56%，相对标准偏差为1.15%～2.29%，说明该方法回收率高。

3 结论

本实验建立了同时测定绿原酸及其5种主要的代谢产物（咖啡酸、阿魏酸、p-香豆酸、3-羟基苯丙酸及马尿酸）的HPLC法，用甲醇和1%的冰醋酸水溶液进行梯度洗脱，6种酚酸类物质在20min内得到了很好的分离。分析结果表明，该方法快速、准确、灵敏度高，能将混合液中6种酚酸类物质进行有效分离，缩短了分析时间，降低了分析成本，为分析检测绿原酸代谢产物提供了方法保障。

表3 各成分的加样回收率结果（n=3）Table 3 The results of recovery test for the method（n=3）

[1]Manach C， Scalbert A， Morand C， et al.Polyphenols：food sources and bioavailability[J].The American Journal of Clinical Nutrition，2004，79：727-747.

[2]肖俊松，单静敏，曹雁平，等.多酚通过肠道菌群调节能量代谢研究进展[J].食品科学，2012，33（3）：300-303.

[3]Lee J，Dossett M，Finn CE.Rubus fruit phenolic research：the good，the bad，and the confusing[J].Food Chemistry，2012，130：785-796.

[4]张鞍灵，马琼，高浸明，等.绿原酸及其类似物与生物活性[J].中草药，2001，32（2）：173-176.

[5]陈绍华，王亚琴，罗立新.天然产物绿原酸的研究进展[J].食品科技，2008（2）：195-198.

[6]刘军海，裘爱泳.绿原酸及其提取纯化和应用前景[J].粮食与油脂，2003（9）：44-46.

[7]Cho AS，Jeon SM，Kim MJ，et al.Chlorogenic acid exhibits anti-obesity property and improves lipid metabolism in high-fat diet-induced-obese mice[J].Food and Chemical Toxicology，2010，48：937-943.

[8]史秀玲，高银辉.绿原酸对小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（19）：199-202.

[9]Chagas-Paula DA，Oliveira RB，Silva VC，et al.Chlorogenic acidsfrom Tithonia diversifolia demonstrate betterantiinflammatory effect than indomethacin and its sesquiterpene lactones[J].Journal of Ethnopharmacology，2011，136：355-362.

[10]Olthof MR，Hollman PC，Katan MB.Chlorogenic acid and caffeic acid are absorbed in humans[J].The Journal of Nutrition，2001，131：66-71.

[11]Lafay S，Gil-Izquierdo A，Manach C，et al.Chlorogenic acid is absorbed in its intact form in the stomach of rats[J].The Journal of Nutrition，2006，136：1192-1197.

[12]Aura AM.Microbialmetabolism ofdietary phenolic compounds in the colon[J].Phytochem Rev，2008（7）：407-429.

[13]Gonthier MP，Verny MA，Besson C.Chlorogenic acid bioavailability largely depends on Its metabolism by the gut microflora in rats[J].Nutrient Metabolism，2003：1853-1860.

[14]Monteiro M，Farah A，Perrone D，et al.Chlorogenic acid compounds from coffee are differentially absorbed and metabolized in humans[J].The Journal of Nutrition，2007，137：2196-2201.

[15]乌兰，张泽生.金银花中绿原酸的提取及检测[J].食品科学，2005，26（6）：130-134.

[16]Mattila P，Kumpulainen J.Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50：3660-3667.

[17]Robbins RJ.Phenolic acids in foods：an overview of analytical methodology[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51：2866-2887.

[18]GonthierMP，RemesyC，ScalbertA，etal.Microbialmetabolism of caffeic acid and its esters chlorogenic and caftaric acids by human faecal microbiota in vitro[J].Biomedicine Pharmacotherapy，2006，60：536-540.

[19]熊艳，王智民，林丽美，等.金银花质量控制方法研究进展[J].中国中医药信息杂志，2009，16（4）：103-104.