鲜切青椒优势腐败菌的分离纯化及鉴定

包英才，王 丹，赵晓燕，马 越，张 超，文连奎

(1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118;2.北京市农林科学院蔬菜研究中心，农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，农业部都市农业(北方)重点实验室，北京100097)

青椒为我国夏秋季节的主要蔬菜之一，鲜切青椒是指新鲜青椒经分级、清洗、切分、包装后，供消费者立即食用或者快餐行业配菜即用的新型蔬菜加工产品［1－2］，具有营养、卫生、美观、便捷等特点［3］。鲜切青椒由于鲜切造成组织结构损伤，原有的保护系统被破坏、汁液外溢。高湿度、较大的鲜切面积及丰富的营养为微生物提供了有利的生长条件，是微生物生长的良好培养基。因此，微生物污染与繁殖在很大程度上导致了鲜切青椒的品质下降［4］，致腐微生物是导致鲜切青椒腐败变质的主要原因［5］。然而，不同蔬菜上的微生物群落差别很大，新鲜叶菜类蔬菜上的主要微生物是假单孢菌属和欧文氏菌属，新鲜番茄上主要为黄杆菌属和假单孢菌属，这些细菌不仅能分解果胶，而且在低温下仍能繁殖存活，致使蔬菜组织腐败［6－7］。目前国内外关于鲜切蔬菜的研究主要涉及:切割果蔬的褐变与护色、贮藏温度、包装方式、不同切割大小和方式、可食性膜的选择以及微生物的控制等几个方面［8］，对于特定腐败微生物的研究较少，尤其是关于鲜切青椒优势腐败菌未有报道。而筛选、鉴定优势腐败菌，研究其特性，能够为进一步有针对性的杀菌处理提供理论基础和技术借鉴，并对其加工过程进行有效控制提供参考［9］。因此，本实验以目前市场上主要的青椒品种为试材，进行鲜切工艺处理，分离筛选出鲜切青椒的优势腐败菌，对其腐败能力进行了验证，并通过生理生化检测对菌株特性做出初步的鉴定。为揭示此优势腐败菌的特性及针对性的杀菌处理提供研究基础，对维持鲜切青椒的产品品质、延长货架期方面具有重要意义［10］。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

“京甜3号”、“中椒7号”、“冠军椒王”、“强舟”四个品种青椒 由北京市小汤山实验基地提供，采后选取大小、重量均一的青椒运输2h后立即贮藏于10℃恒温恒湿箱内预冷;蛋白胨、牛肉膏、营养琼脂培养基 由北京奥博星生物技术有限责任公司提供;氯化钠、氢氧化钠、次氯酸钠 由北京化工厂提供;AIP 20E、API 50CH试剂盒 均委托北京宝杰罗生物公司购买。

ZEALWAY灭菌锅 美国致微公司;HDL APPARATUS超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司;INCUCELL培养箱 德国MMM公司;UV－1800型紫外可见分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鲜切青椒腐败率的测定 腐烂率(%):将100g青椒切成大小均一的小块儿放入盒子里，每隔1d计数发霉、腐烂的产品，以表面有腐烂的切块占总切片的百分数表示，重复3次取平均值。

1.2.2 鲜切青椒中优势菌株的分离纯化 采用平板计数法在营养琼脂培养基上，37℃培养24～48h;从10－8、10－9挑取占优势且形态不同的单菌落进一步划线分离，进行培养。将上述培养基中长出的菌株在营养琼脂培养基上划线培养，等出现单个菌落时转接到新营养琼脂培养基中继续培养，重复上述操作即可得到纯化菌种。菌种编号后转接到试管斜面4℃冰箱保存备用。初步观察其菌落形态和大小、边缘、表面、隆起形状、颜色及透明度等［11］。

1.2.3 鲜切青椒优势菌株反证实验 选取1.2.1中得出的最易腐败的品种鲜切青椒和健康的整块青椒，先用纯水清洗，再用200ppm浓度次氯酸钠水冲洗。浸泡于制备好的不同浓度的菌悬液中，分别进行“有伤”和“无伤”接菌。在10和25℃下贮藏。逐日观察并记录果实和果块的腐败情况，从而判断所接菌种是否为优势腐败菌。

1.2.4 细菌鉴定 革兰氏染色;API20E试条:根据API20E试条操作指南进行生化鉴定;API50CH试条:根据API50CH试条操作指南进行生化鉴定;

1.3 数据处理

图像绘制采用Origin 8.1软件(美国Origin Lab Corporation公司)，并对数据显著性分析，置信区间为95%。

2 结果与分析

2.1 鲜切青椒腐烂率的变化

青椒在贮藏期间因微生物污染因素而腐败，本实验对不同品种青椒在贮藏期腐烂程度进行研究，分别在10、25℃条件下贮藏，观察不同天数后的腐烂率。结果见图1、图2。

图1 不同品种鲜切青椒10℃贮藏期间腐烂率的变化Fig.1 Changes of corruption rate in different varieties of fresh cut green peppers at 10℃during storage

图1结果可知供试品种鲜切青椒果实随着贮藏时间的延长，腐烂率有明显上升趋势。与未贮藏相比，鲜切“冠军椒王”、“强舟”在第4d、“中椒7号”在第3d出现腐烂，8d完全腐烂;“京甜3号”第3d开始有腐烂第7d完全腐烂。由此可见，鲜切“京甜3号”腐烂程度最严重，因此以第7d各品种鲜切“京甜3号”青椒腐败组织为研究对象，筛选优势菌株。

图2 不同品种鲜切青椒25℃贮藏期间腐烂率的变化Fig.2 Changes of corruption rate in different varieties of fresh cut green peppers at 25℃during storage

图2结果可知25℃贮藏条件下，所有供试品种鲜切产品较10℃贮藏条件下腐败快，第1d均开始有明显腐烂。“京甜3号”第3d腐败率已经达到了90%，而其它品种鲜切青椒腐败率也在贮藏的第4d达到了100%。由此可见，鲜切“京甜3号”腐烂程度最严重、腐烂速度最快、最不易储藏，因此以第3d腐败组织为研究对象，筛选优势菌株。

2.2 鲜切青椒中优势菌株的分离纯化

供试品种青椒，平板计数法筛选优势菌，10倍梯度稀释8次后仍有很多种菌株，其中有两个菌株的量最大，以菌株A和菌株B表示。采用平板划线法进一步分离纯化A和B两个优势菌，在营养琼脂培养基上的形态观察结果见表1。

2.3 菌种返接鲜切青椒的腐败性观察及主要腐败菌的鉴定

生长优势菌不一定为主要腐败菌，进一步通过反接验证其腐败性，最终鉴定A、B是否为优势腐败菌。结果见表2。

表1 腐败鲜切青椒中菌落形态鉴定结果Table 1 Colony morphology identification results in the corruption of fresh－cut green pepper

表2 鲜切青椒接种的腐败情况Table 2 The decayed situation of fresh－cut green pepper after artificial inoculation

表3 菌株B的生理生化特性Table 3 The physiological and biochemical character of Strain B

由表2可知25℃储藏3d，10℃贮藏5d，无论接种高浓度还是低浓度A菌株的鲜切青椒均没有发生腐烂，而接种高浓度和低浓度B菌株的青椒均产生了明显的腐败现象。可以看出，菌株A没有致腐性，不是鲜切青椒腐败菌;B具有明显致腐性，为鲜切青椒优势腐败菌。

2.4 优势腐败菌初步鉴定

由2.3得知菌株B为主要腐败菌，经过显微镜观察及革兰氏染色结果得知菌株B为阴性杆状细菌，生理生化性质测定结果见表3。

结合API20E试条和API50CH试条说明书判定，菌株B为欧文氏菌，这与韩巍巍等［1］的报道结果相似:蔬菜组织中含酸量低，易遭受土壤细菌侵染，如欧文氏菌、假单孢菌、黄单孢菌等，致使蔬菜组织腐败。而鲜切青椒中的优势腐败菌属于欧文氏菌属中哪一个种需要进一步鉴定。

3 结论

3.1 通过对鲜切“京甜3号”、“中椒7号”、“冠军椒王”、“强舟”四个品种青椒的腐败组织中优势菌株的分离筛选，得到A、B两个优势菌株。

3.2 微生物反接实验结果表明菌株A对鲜切青椒没有致腐能力，B使鲜切青椒组织发生腐烂，是鲜切青椒的优势腐败菌。

3.3 经过菌落形态观察、革兰氏染色、生理生化鉴定结果可知菌株B为革兰氏阴性杆状菌株，欧文氏菌，具体种的鉴定有待进一步研究。

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