环介导等温扩增技术快速检测椰毒假单胞菌的研究

马晓燕，张蕴哲，王 羽，刘 哲，王晓丽，张 伟，*

(1.河北农业大学食品科技学院，河北保定071001;2.河北大学附属医院河北保定071000;3.石家庄科技信息职业技术学院，河北石家庄050081;4.保定科技职业学院，河北保定071000)

椰毒假单胞菌(Pseudomonas cocovenenans)主要存在于发酵的玉米、糯玉米、黄米、高梁米、变质银耳中，是一种导致食物中毒的、致死率极高的病原微生物，该菌引起的食物中毒在国内外早有报道［1－3］。椰毒假单胞菌食物中毒发病急，症状表现复杂多变，临床上分脑型、肝型、肾型及混合型四型。由于椰毒假单胞菌食物中毒流行规模较大、发病率和病死率极高，而且目前缺乏特效的解毒措施。因此椰毒假单胞菌的检测方法是否灵敏、快速至关重要。目前对椰毒假单胞菌的检测主要采用传统生理生化和免疫学方法，例如GB/T4789.29－94(椰毒假单胞菌酵米面亚种的检验)，检测过程费时费力，而且灵敏度较低［4］。除此以外也有利用薄层层析、高效液相色谱、紫外分光光度、ELISA等方法检测椰毒假单胞菌所产生的外毒素的。近年来，椰毒假单胞菌的分子检测方法取得重要进展，基于保守序列16S rRNA、23S rRNA以及16S～23S rRNA间区序列，利用PCR、产物测序分析及脉冲场凝胶电泳等技术的分子检测相继建立［5－7］，但是这些方法绝大多数都需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程以及对检测人员的较高技术要求等，使其在基层难以普及和推广。环介导等温扩增技术(Loop－mediated Isothermal Amplification，简称LAMP)是2000年由日本的荣研株式会的Notomi T等［4－5］开发出来的一种新的核酸扩增方法。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，具有高特异性和等温快速扩增的特点，近期相关研究成果表明，LAMP法检测在各种食源性致病菌方面具有良好的潜力［8－11］。利用 LAMP 技术检测椰毒假单胞菌国内外鲜有报道。本研究以椰毒假单胞菌的16S～23S rRNA为靶基因设计内、外引物，建立LAMP反应体系和扩增程序，实现对食品中椰毒假单胞菌的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

椰毒假单胞菌(Pseudomonascocovenenans，NCIB9450)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，CICC21600)、阪 崎 肠 杆 菌 (Enrerobacter sakazaki，ATCC29544)、蜡 样 芽 孢 杆 菌 (Bacilluscereus，CMCC63302)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，CICC 22945)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans，CICC 20139)、致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli EPEC O78:K80、CICC 10372)、单核增生性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes、CMCC54001)、甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella schottmuelleri、CMCC50001)、普通变形杆菌(Proteus vuLgaris，CMCC49027)、宋 内 志 贺 氏 菌 (Shigella sonnei，CMCC51334)以上菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)和中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)。

银耳 购自保定当地市场;氯化钠、乙醇等其它试剂 均为分析纯;LAMP，PCR引物等 购自或合成于上海生工生物工程有限公司;dNTP、DNA Marker 100bp、6 × Loading buffer、MgCl2、TaKaRa Taq DNA ploymerase、10×PCR buffer 大连宝生物工程技术服务有限公司;BSTst DNA聚合酶 购自New England Biolabs公司;溴化乙锭(EB)Sigma公司。

PCR扩增仪(Whatman T Gradient基因扩增仪)德国Biometra公司;恒温培养箱、凝胶成像系统(BINDA 2020D)北京宾达英创科技有限公司;电泳仪(DXY－33A型)北京市六一厂;微量移液器(0.5～10μL、10～100μL，DrgonMed Pipette)等。

1.2 实验方法

1.2.1 椰毒假单胞菌的培养 取保藏的椰毒假单胞菌在PDA固体培养基中进行斜面划线，恒温箱37℃培养18～24h，传代培养2次。挑取单个菌落接种于新鲜无菌的液体LB培养基中，37℃120r/min振荡培养过夜。

1.2.2 椰毒假单胞菌基因组DNA的提取 菌株用LB培养基培养至对数生长期，培养液在10000r/min离心5min，弃去上清，收集菌体。加入500μL 10×TE Buffer洗涤沉淀2次，重悬菌液，加入10%SDS溶液100μL，于 65℃水浴 10min。加入500μL 苯酚/氯仿/异戊醇8000r/min离心10min，以大口径吸管小心移出上清液;加入等体积的异戊醇/氯仿(1∶24)混匀使之成为乳浊状，10000r/min，离心1min，取上清。重复脱蛋白2次，使中间无蛋白层，吸取上层水相。加入25μL乙酸钠(pH5.2)和500μL预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，冰浴10min沉淀;14000r/min离心5min，小心吸出上清液，DNA沉淀物自然风干后，加入100μL TE缓冲液，4℃备用或－20℃保存。

1.2.3 引物设计、反应体系及反应程序 针对椰毒假单胞菌GenBank中(基因号 EF552059)16S～23S rRNA基因序列，运用在线引物设计软件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)设计LAMP引物(见表1)。引物设计原则参照Notomi T［5］。借助RNA Structure软件对备选引物的二级结构进行分析、筛选，确定最佳引物。每条引物在基因组中的位置如图1所示。PCR引物参照文献［6］(见表2)。

表1 LAMP引物Table 1 Primers of LAMP

图1 每条引物在基因组中的位置Fig.1 Each primer in the genome of the location.

表2 PCR引物Table 2 Primers of PCR

1.2.3.1 LAMP和PCR反应体系 25μL LAMP反应体系:内引物(FIP和BIP)各3μL，外引物(F3和B3)各 0.5μL，2.5mmol dNTP 4.5μL，25mmol MgCl23μL，10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液，8U的Bst DNA聚合酶大片段，2μL DNA模板和用灭菌双蒸水补足体系。

PCR反应体系:为了比较LAMP检测椰毒假单胞菌灵敏度，进行了PCR反应，PCR引物见表3。同时可用LAMP引物的两条外引物(F3和B3)作为PCR的引物使用。50μL PCR反应体系包括:10×聚合酶链反应缓冲液(100mmol Tris－HCl(pH8.3)，500mmol(KCl))，25mmol MgCl22μL，2.5mmol dNTP 5μL，上下游引物各 1μL，5U 的 Taq DNA 聚合酶，8μL的DNA模板和用灭菌双蒸水补足体系。

1.2.3.2 LAMP和PCR反应程序 LAMP操作程序:首先在62℃水浴锅中反应30min，然后将其放入80℃水浴锅中，水浴10min终止反应，通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀。进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察梯形条带，以证实是否发生了LAMP反应。PCR操作程序:预变性 94℃，5min;变性 94℃，30s，退火55℃，30s，延伸 72℃，1min，进行 33 个循环;最终72℃延伸10min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

2 结果与讨论

2.1 LAMP引物特异性的研究

从1.1.1所有供试菌株中按1.2.2的方法提取DNA进行LAMP扩增检测引物特异性，其琼脂糖凝胶电泳图如图2所示。只有椰毒假单胞菌扩增出特异性片段，而用纯水做模板的阴性对照和其它10株肠道致病菌的扩增结果均显示为阴性。可见该方法具有较好的特异性。

图2 LAMP引物特异性的检测结果Fig.2 The specificity of the LAMP primers

2.2 椰毒假单胞菌纯培养灵敏度的研究

2.2.1 LAMP检测椰毒假单胞菌的灵敏度 过夜培养的椰毒假单胞菌的菌悬液(浓度为5.4×109CFU/mL)，10倍梯度稀释菌液，按1.2.3.1和1.2.3.2进行LAMP检测椰毒假单胞菌，测定其灵敏度，结果如图3所示。在稀释到109倍(5.4CFU/mL)时电泳有梯形条带。而稀释到1010倍(5.4×10－1CFU/mL)时电泳无梯形条带。即LAMP检测椰毒假单胞菌的灵敏度达到5.4CFU/mL。

图3 LAMP检测椰毒假单胞菌的灵敏度Fig.3 The sensitivity of LAMP for detection of Pseudomonas cocovenenans in pure cultures by LAMP

2.2.2 PCR检测椰毒假单胞菌的灵敏度 过夜培养的椰毒假单胞菌的菌悬液(浓度为5.4×109CFU/mL)，10倍梯度稀释菌液，按1.2.3.1和1.2.3.2进行常规PCR检测椰毒假单胞菌，测定其灵敏度。结果如图4所示:PCR扩增得到一条231bp的目的片段，与预期结果相符，PCR检测椰毒假单胞菌的灵敏度为5.4×103CFU/mL。综上可知，与 PCR相比，LAMP方法检测椰毒假单胞菌更加灵敏，其灵敏度是PCR的1000倍。

图4 PCR检测椰毒假单胞菌的灵敏度Fig.4 The sensitivity for detection of Pseudomonas cocovenenans in pure cultures by PCR

2.3 LAMP检测人工污染银耳的检出限

经细菌计数可知，过夜培养的椰毒假单胞菌的菌悬液浓度为7.6×108CFU/mL，即人工污染银耳样品中椰毒酵假单胞菌的原始浓度为7.6×108CFU/g。按试剂盒法处理样品提取DNA，进行LAMP检测人工污染银耳中的椰毒假单胞菌的检出限实验。结果如图5所示:利用LAMP方法，从人工污染银耳样品中成功地检测出椰毒酵假单胞菌，检出限是76CFU/g。

3 结论

图5 LAMP检测人工污染银耳中椰酵假单胞菌的检出限Fig.5 The detection limit of LAMP for detection of Pseudomonas cocovenenans of artificially tremella sample.

LAMP作为一种新型的恒温核酸扩增技术，它针对靶序列的6个特定区域设计引物，借助具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下就可以扩增核酸，既保证了扩增的特异性，也提高了扩增效率。它的扩增产物是由多重复靶序列的茎环状DNA和花椰菜状DNA组成，因此琼脂糖凝胶电泳后会呈现特有的典型的阶梯状条带。此外，在扩增形成大量核酸时，从dNTPs中析出的焦磷酸根离子与反应体系中的Mg2+结合，还可产生肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀，从而使结果鉴定简单化，省略电泳过程，提高检测速度。

本研究针对椰毒假单胞菌16S～23S rRNA基因序列在线设计了LAMP引物，建立了快速检测椰毒假单胞菌的LAMP检测体系，灵敏度为5.4CFU/mL;与传统PCR方法相比较，LAMP方法检测灵敏度是常规PCR的1000倍，且将整个检测时间缩短为2h;LAMP方法检测人工污染银耳产品中椰毒假单胞菌的检出限为76CFU/g。综上所述，本研究建立的LAMP快速检测椰毒假单胞菌方法，具备灵敏度高，耗时短，特异性强，方法简便，费用低等特点且仪器要求简单，便于在基层推广，具有很好的应用前景。

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