基于统计学方法的酱油二次沉淀形成的初步研究

高献礼，闫 爽，陈燕斌，陆 健*

(1.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122;2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡2141222;3.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122)

据中国产业信息网数据显示(http://data.chyxx.com/shpyl/201103/K 79165 A8GP.html)，2011年我国酱油产量达662万t，是我国调味品和食品工业的重要组成部分。但随着我国人民生活水平的不断提高和国外(主要是日本、韩国)高档次酱油进入国内市场，消费者不但要求酱油具有良好的调味、去腥和上色功能，而且对酱油的外观质量(如是否有沉淀、长霉等)的要求也越来越高。近些年消费者对国产酱油投诉最多，也是我国酱油行业普遍存在的质量问题，即酱油在储存和销售过程中的沉淀(酱油脚)问题，其严重影响了产品的外观稳定性、消费者的购买欲和企业的形象，导致企业竞争力下降［1－4］。因此，酱油企业要提高市场竞争力，必须提高产品质量，而解决酱油的沉淀问题是其需要解决的首要问题。目前国内外对酱油二次沉淀形成的机理及影响因素的研究仍然存在争议或不够深入。如国内学者认为酱油二次沉淀的产生主要是酱油中的部分疏水性较强的蛋白质引起的，受多糖、脂肪、盐等的影响较小［5－8］。而日本学者指出酱油二次沉淀受酱油的热凝性影响，生酱油中存在促进酱油二次沉淀形成的促沉因子。曲霉中的蛋白酶、α－淀粉酶、果胶裂解酶、木聚糖酶等对酱油的热凝结起促进作用，其中以碱性和中性蛋白酶的影响最大［9－10］。此外，Pedro等［11］研究结果显示非特异性蛋白酶 α－胰蛋白酶在高浓度盐的作用下能够生成类蛋白，这种类蛋白的疏水性比底物高得多，而这种类蛋白可以通过转肽作用富集疏水性氨基酸，生成不溶于水的疏水性肽类，浓缩成小颗粒后，形成不溶于水的类蛋白。由以上分析可知，国内外学者对酱油二次沉淀的主要成分及其机理进行了初步的研究，但对导致酱油二次沉淀形成的主要成分、影响因素和机理并未形成被广泛认可的共识。本文基于统计学原理，以pearson相关性分析法研究了酱油各指标与酱油二次沉淀形成的相关性，以T检验法研究了酱油不同发酵方式、类型、原料、质量等级和产地对酱油二次沉淀形成的影响，为进一步深入认识导致酱油二次沉淀形成的主要成分、机理及影响因素提供实验数据和方法支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验材料见表1。硫酸铜、亚甲基蓝、酒石酸钾、亚铁氰化钾、葡萄糖、硝酸银、铬酸钾、甲醛溶液、考马斯亮蓝G－250、乙酸镁、四硼酸钠、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钙、柠檬酸、Tris、SDS、过硫酸铵、溴酚蓝、无水乙醇、冰醋酸 均为分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司。

FE20实验室pH计 梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司;Kjeitec2300凯氏定氮仪 瑞典FOSS分析仪器有限公司;WFZ UV－2100紫外分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;H1850R台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;5415D高速离心机 德国艾本德(Eppendorf)股份公司;Freezone 4.5真空冷冻干燥机 美国Labconco公司。

1.2 实验方法

将表1中各酱油样品常温下静置7d以上，取上清液进行以下理化指标的测定。

1.2.1 pH的测定 FE20 pH计直接测定。

1.2.2 还原糖和总糖的测定 还原糖的测定方法参照GB/T 5009.7－2003法。总糖的测定方法如下:吸取样品2～10mL(控制样品总糖含量 1～2g/L)于500mL容量瓶中，加水50mL和6mol/L盐酸5mL，68～70℃水浴加热15min。冷却后加入甲基红指示液2滴，用200g/L的NaOH溶液滴定至红色消失(近中性)。加水定容、摇均、冷却后备用。其他步骤参照还原糖测定方法GB/T 5009.7－2003。

1.2.3 NaCl的测定 NaCl含量的测定方法参照GB/T 5009.39－2003。

1.2.4 氨基酸态氮和总氮的测定 氨基酸态氮和总氮的测定方法分别参照GB/T 5009.40－2003和微量凯氏定氮法GB 5009.5－85。

1.2.5 无盐固形物含量的测定 无盐固形物含量的测定方法参照GB 18186－2000方法。

表1 酱油样品基本信息Table 1 Information of soy sauce samples

1.2.6 沉淀制备方法 酱油二次沉淀制备方法参照文献［12］，修改如下:将 500mL酱油摇均后在4500r/min、4℃ 下离心 30min，去除上清，分别用10mL上清洗涤沉淀3次并转入50mL离心管中。同样在4500r/min、4℃下离心30min，弃上清，收集沉淀。将收集的沉淀在－40℃下冷冻4h，样品进行抽真空冷冻干燥，最后在105℃烘干至恒重得酱油二次沉淀。

1.3 数据分析

所有实验数据测定3次，取其平均值。运用SPSS 11.5软件进行 Pearson相关性分析和Independent－Samples T Test分析。

2 结果与讨论

2.1 酱油理化指标测定结果

由表2可知，25种市售酱油的pH、总糖、还原糖、NaCl、总氮、氨基酸态氮、无盐固形物及二次沉淀含量的变化范围分别为4.18～5.29、17.23～78.32g/L、10.76～45.65g/L、11.00～19.45g/100mL、0.28～2.04g/100mL、0.15～1.48g/100mL、7.86～34.32g/100mL、0.18～2.98g/L。其中25种市售酱油二次沉淀含量的平均值和标准偏差为:(0.90±0.74)g/L。

表2 酱油中各理化指标的测定结果Table 2 Determination results of physicochemical indices of soy sauces

2.2 酱油理化指标与二次沉淀形成的相关性分析

由表3可知，经pearson相关性分析得出酱油二次沉淀的形成与酱油中总糖、总氮和无盐固形物含量呈显著性相关，而与酱油pH及还原糖、NaCl、氨基酸态氮含量无统计学意义上的相关性。曾新安等［5］和张志航等［7］通过理化分析得出蛋白质和多糖是酱油二次沉淀的两类主要成分，本文通过统计学分析证明酱油中总氮和多糖含量与酱油二次沉淀的形成密切相关。此外，蛋白质和多糖是酱油无盐固形物的主要组成部分，其含量与酱油二次沉淀形成密切相关具有理论上的合理性。此外，曾新安等［5］的分析结果表明酱油二次沉淀的形成与NaCl含量及pH无关，这与本文基于统计学原理分析的结果一致。

2.3 影响酱油二次沉淀形成因素的分析

由表4可知，不同质量等级酱油的二次沉淀含量存在较大差异，如特级酱油分别比一级/二级酱油和三级酱油二次沉淀含量高148.89%和21.74%，说明质量等级对酱油二次沉淀含量具有较大影响，即质量等级越高、总氮含量越高，其二次沉淀含量可能越高(本研究一级/二级酱油样本偏少，对分析结果可能有一定的影响)。与东北/日本产酱油相比，华南、华东、华北产酱油二次沉淀的含量分别比东北/日本产酱油二次沉淀含量高 90.57%、94.34%、64.15%，说明不同产区对酱油二次沉淀的形成有明显的影响。可能的原因为我国东北地区及日本与我国的华南、华东和华北地区存在较为明显的年平均气温差异(http://info.datang.net/Z/images/6213－b01.jpg)，而发酵温度对酱油二次沉淀的形成具有重要影响［4，13］。此外，由表 4 可知，不同发酵方式和主要生产原料对酱油二次沉淀的形成也存在明显的影响。如低盐固态酱油比高盐稀态酱油二次沉淀含量高49.37%;以大豆为主要原料生产的酱油比以豆粕为主要原料生产的酱油的二次沉淀含量高51.95%。但不同类型酱油(老抽和生抽)之间的二次沉淀含量差异较小(15.12%)。

表3 酱油各理化指标与酱油二次沉淀形成相关性分析结果Table 3 Analysis results of correlation between physicochemical indices and secondary sediments of soy sauces

表4 酱油二次沉淀含量经T Test检验分析结果Table 4 Results of secondary sediment contents of soy sauces analyzed by T Test

3 结论

本文基于统计学分析法研究了酱油pH及总糖、还原糖、NaCl、总氮、氨基酸态氮、无盐固形物含量与酱油二次沉淀形成的相关性及影响酱油二次沉淀形成的因素。得出如下结论:

3.1 酱油二次沉淀的形成与酱油中总糖、总氮和无盐固形物的含量显著性相关。

3.2 酱油发酵方式、主要原料、质量等级和产地对酱油二次沉淀的形成具有较大影响，而酱油类型对酱油二次沉淀的形成无明显的影响。

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