加减银翘散提取工艺的优化

辽 宁 医 学 院 蒋 红 王宏军＊ 禹 嫙

中牧实业股份有限公司 李新国

天津市宝坻区人民医院 武新亮

加减银翘散，以金银花、连翘为君药，甘草为佐使药，引入天花粉为臣药，符合中兽医药理论，该组方被本课题组命名为银翘天甘，并已开展了该方的药理活性研究、药物剂量配比研究、活性成分研究及含药血清制备工艺的研究 （耿鸣禹等，2012；王宏军等，2011；邹宇等，2009；王宏军等，2009）。为提高银翘天甘制剂的浸出率，采用L9（34）正交试验设计，以乙醇浓度、提取时间、提取次数、提取方法为影响因素，以浸膏率及抗菌活性作为评定指标优化其最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鸡源性大肠杆菌（CMCC44102），由中国兽药监察所提供；猪链球菌，由辽宁医学院兽医微生物实验室提供。

1.1.2 中草药 金银花、连翘、天花粉、甘草购自易达中药饮片有限公司（批号：20080425），经鉴定为正品。

1.1.3 试剂 营养琼脂 （杭州微生物试剂有限公司，批号：20070226）；营养肉汤（北京奥博星生物技术责任有限公司，批号：20050103，20070226）；无支原体新生牛血清 （杭州天杭生物科技有限公司，批号：101115）；按照成品培养基说明调配而成，121℃高压灭菌20 min后，琼脂培养基制成平板，4℃冰箱保存备用。

1.1.4 主要仪器 YH-350Z型全自动不锈钢双层立式电热蒸汽压力消毒器，上海三申医疗器械有限公司；DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；隔水式恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；QE-200 g型粉碎机，武义县屹立工具有限公司；KQ-300B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；索氏提取器，天津市北辰区光明玻璃仪器厂；RE-5203型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-ⅢB型循环水真空泵，浙江临海市精工真空设备厂；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 组方设计 将金银花、连翘、天花粉、甘草4味药按比例组方（王宏军等，2011），粉碎，过60目筛，称取若干份，以乙醇浓度、提取次数、提取时间、提取方法作为考察因素，每个因素设3个水平（表 1），进行 L9（34）正交试验。

表1 试验因素与水平

1.2.2 中草药提取 按表1设计的因素水平和表2安排的提取工艺条件提取银翘天甘制剂，减压浓缩，60℃干燥至恒重，每组重复3次，按下式计算浸膏率。

1.2.3 血清培养基的制备 液体培养基冷却后，配制成含10%血清的液体培养基；固体培养基温度降到55℃左右时加入血清，配制成含10%血清的培养基，混匀后浇平板，4℃冰箱保存备用。

1.2.4 试验菌悬液的制备 取菌种0.5 mL放入10 mL适宜的液体培养基中混匀，37℃恒温培养18～24 h为原菌液。采用活菌计数方法推算原菌液中细菌的个数（陈奇，1992）。用灭菌生理盐水将菌液稀释到105CFU/mL即为供试菌液。

1.2.5 最小抑菌浓度的测定 用微管-平板法测定最小抑菌浓度（MIC）。

1.2.6 抗菌活性综合评分 采用抗菌活性综合评分（Z）方法，评价不同工艺制备的银翘天甘制剂对鸡大肠杆菌、猪链球菌活性的综合效应，按下式计算：

式中，X为银翘天甘制剂对鸡大肠杆菌的MIC；Y为银翘天甘制剂对猪链球菌的MIC；i为试验序号1～9；max为MIC的最大值。

1.2.7 验证试验 以浸膏率和抗菌活性为响应值，将获得最优工艺按照相应方法进行验证试验，重复6组，以确定银翘天甘制剂的最优提取工艺。

1.2.8 统计分析 正交试验采用极差分析法，验证试验采用t检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 浸膏率 由表2可见，极差结果显示，4个因素的显著顺序为：D＞B＞A＞C，最优提取工艺为：A3B3C3D3。

2.2 抗菌活性 分别对9个工艺获得的银翘天甘制剂进行抗鸡大肠杆菌和猪链球菌抗菌活性的测定，银翘天甘制剂对鸡大肠杆菌和猪链球菌的MIC均在0.125～0.5 g/mL。由表2可见，由抗菌活性综合评分作为响应值，4个因素的显著顺序为：C＞D＞B＞A，因抗菌活性是MIC值越小表明活性越高（陈奇，1992），故以抗菌活性为响应值时，最优提取工艺为：A3B2C2D3或A2B2C2D3。

表2 L9（34）正交试验设计及结果

2.3 验证试验 分别以浸膏率和抗菌活性综合评分得到3个较优提取工艺（表3）。由表3可见，工艺2浸膏率达到最大值60.61%，与工艺1和工艺3均差异极显著 （P＜0.01）；对鸡大肠杆菌的MIC为0.125 g/mL，对猪链球菌的MIC为0.177 g/mL，与工艺3差异显著（P＜0.05）。

表3 银翘天甘提取工艺验证试验结果

3 讨论

3.1 中草药复方提取工艺的设计 大量研究表明，绝大多数中草药复方提取工艺的试验研究采用正交试验设计的方法（陈坚平和王思鸿，2008），也有的采用均匀设计法（赵瑞芝等，2006），正交试验设计方法应用最为广泛，简单易行，不但节约了大量的时间而且也节省了大量的材料。由表2和表3可知，超声波+索氏提取法能够提高银翘天甘制剂的浸膏率，再配合70%乙醇，浸膏率明显升高；而从抗菌活性方面来看，该方法的影响相对要小很多。

3.2 优选提取工艺的评定方法 提取工艺的评定方法，常用的是测定某一成分的含量来进行评定，如浸膏重（刘春海等，2006）。陈坚平和王思鸿（2008）用正交试验法优选复方当归苦参片的提取工艺研究中以提取液中阿魏酸的含量以及总固体得率的综合评定为评价指标。在银翘天甘提取工艺筛选中，认为中草药复方制剂的浸膏率是未来工业生产重要关注点，至于活性成分，也是需要考虑的，但作为一个中草药复方发挥作用的成分可能不只一种，那么只检测某一种成分的含量不足以说明问题，所以检测指标引入了药理活性，金银花、连翘、甘草均具有抗菌活性，此外，该组方的创制也是以抗细菌感染为主，故采用浸膏率与抗菌活性作为响应值进行综合评定，为该制剂开发成抗菌口服液奠定基础。

通过正交试验得出中草药复方银翘天甘的提取工艺为A3B2C2D3即乙醇浓度为70%，提取2次，每次提取1 h，提取方法为超声波与索氏提取相结合，浸膏率可达到60.61%，对鸡大肠杆菌的MIC为0.125 g/mL，对猪链球菌的MIC为0.177 g/mL。

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