一株疑似胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及药敏试验

张桂华1,李润成*

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128；2.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128）

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的具有高度传染性和致死性的呼吸道疾病，该病发病急，死亡快，而且耐过猪和带菌猪均是本病暴发和流行的潜在传染源，给养猪业造成了严重的经济损失[1]。感染动物的典型临床特征是肺坏死、出血和纤维素性渗出[2]。本文通过对分离的疑似胸膜肺炎放线杆菌进行PCR鉴定及药敏试验，为该病的诊断及防治提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料：病死猪的肺脏、心脏等病变组织。

1.1.2 主要培养基：巧克力琼脂培养基，兔鲜血琼脂培养基购自贝瑞特生物技术有限责任公司；胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB）购自美国Fluka公司。

1.1.3 主要试剂：各种药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；各种生化鉴定管购自广东环凯微生物科技有限公司；V因子（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.4 试验动物：8只18～22g昆明雌鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离：用接种环无菌挑取病猪肺脏和心脏病变组织，分别接种于兔血琼脂培养基和巧克力琼脂培养基，置烛缸中3 7℃培养12～24h，观察生长状况。

1.2.2 形态学观察：挑取大小、形态一致的单个菌落，均匀涂布于滴有生理盐水的载玻片上，进行革兰氏染色，镜检，观察细菌形态。

1.2.3 V因子（NAD）依赖试验：将分离菌分别接种于三种液体培养基中培养，一种为无NAD含有犊牛血清的TSB，另一种为添加NAD和犊牛血清的TSB，同时设不加NAD和犊牛血清的对照管，37℃有氧条件下培养18h，观察肉汤的浑浊度。

1.2.4 生化试验：先于生化管中加入V因子,使其终浓度达100μg/m L，然后按常规方法将分离的疑似胸膜肺炎放线杆菌分别接种于各种生化反应管中，置3 7℃培养，2 4～4 8 h后观察生化反应情况。

1.2.5 P C R鉴定：根据已发表的胸膜肺炎放线杆菌的o m L A基因序列设计了一对特异性引物，序列如下：上游引物 Fp5’-GGCGGCTCATCGGGTTCAT-3’，下 游 引 物 Rp5’-TTTATCTTCTTTTGTGGTTGCC-3’。扩增片段大小约为1029bp，PCR扩增按常规方法进行。

1.2.6 动物致病性实验：将8只昆明雌鼠随机分成两组，分为试验组和对照组，每组4只。试验组每只小鼠按0.1mL/只腹腔注射菌液（将原培养物离心后用相同体积的TSB悬浮沉淀，细菌数约为2.4×107），对照组注射相同剂量的TSB。观察小鼠生长情况，对死亡小鼠进行解剖，观察病变并分离培养细菌。

1.2.7 药敏试验：将培养好的菌液均匀涂布于巧克力平板上，然后按常规的纸片法，贴上药敏纸片，置烛缸中37℃培养，24h后观察抑菌圈大小。

2 结果

2.1 细菌分离及培养特性

该菌在兔血琼脂平板上不生长，在巧克力琼脂平板上长出针尖大小、半透明的呈粘性的菌落，镜检为革兰氏阴性球杆菌；只在同时加有N A D和牛血清的T S B中变浑浊，另外两管均不见浑浊。

2.2 生化试验

按1.2.5操作进行生化试验，生化试验结果见表1。

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2.3 PCR鉴定

用设计的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌o m L A基因引物，对分离菌进行P C R检测，扩增出了大小约为1 0 2 9 b p的特异性条带，结果与预期的大小一样，见图1。

2.4 细菌致病性检测

用分离的该纯培养物给小鼠攻毒，约2 h后开始发病，表现为被毛粗乱，挤堆，嗜睡，呼吸急促。试验组小鼠均在1 2 h内死亡，个别死亡小鼠尿道处有红色分泌物，鼻孔出血，对照组小鼠正常。解剖死亡小鼠，急性死亡的可见肺脏出血，从肺、脾、肝中均能分离到该细菌，解剖对照组小鼠则未见到任何病变。死亡小鼠临床症状见图2。

2.5 药敏试验

共选用了1 8种药物，极度敏感的药物为头孢噻吩，高度敏感的有新霉素、头孢唑林、强力霉素、头孢氨苄、头孢拉定、氧氟沙星、恩诺沙星、奈替米星及环丙沙星，中度敏感的药物有氯霉素、大观霉素、青霉素G、复方新诺明、头孢他啶、卡那霉素及红霉素，低敏感的药物则是阿奇霉素，结果见表2。

3 讨论

经临床初诊和染色镜检，初步判定该菌可能为胸膜肺炎放线杆菌。结合NAD依赖性试验及生化鉴定结果，并与Kielstein[3]报道的猪N A D依赖的巴斯德氏菌科细菌的生化试验结果作比较，最终可以确定该菌为胸膜肺炎放线杆菌，P C R鉴定结果也证实了这一结论，但是该分离菌不能产生H2S，与彭娟等[4]报道的A P P菌株不能产生H2S相符，但与陈凯[5]、刁友祥[6]报道的A P P菌株能够产生H2S不符，这可能是由于菌株差异造成的。细菌致病性检测表明该菌具有较强的致病性，这与该猪场生猪发病严重的临床表现相符。细菌药敏试验结果表明，该菌对头孢噻吩极度敏感，对头孢唑林、强力霉素、头孢拉定、氧氟沙星等药物高度敏感，对阿奇霉素则不敏感。从药敏试验结果可见本文分离的该株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌没有产生很强的耐药性，采用敏感药物预防和控制疾病的发展应该能起到良好的作用。 □

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[1]Taylor DJ.Actinobacillus pleuropneumoniae.In:D’allaire S,Megeling WL,Taylor DJ,Straw BE,editors.Diseases of swine.8th ed.Ames,IA:Iowa State University Press;1999,343～54.

[2]Bosse JT,Janson H,Sheehan BJ,Beddek AJ,Rycroft AN,Kroll JS,et al.Actinobacillus pleruopneumoniae:pathobiology and pathogenesis of infection.Microbes Infect 2002;4(2):225～35.

[3]Kielstein P,Wuthe H,Angen O,Mutters R,Ahrens P.Phenotypic and genetic characterization of NAD～dependent Pasteurellaceae from the respiratory tract of pigs and their possible pathogenetic importance[J].Vet Microbiol,2001,81:243～255.

[4]彭娟,杨泽晓,宋勇,等.猪胸膜肺炎放线杆菌四川株的分离鉴定及药物敏感性试验[J].中国畜牧兽医,2011,38(10):221～223.

[5]陈凯,杜爱庆,张伟,等.淄博地区猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].山东畜牧兽医,2007,30(3):11～12.

[6]刘霞,刁友祥,赵乐,等.猪胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定[J].家畜生态学报,2006,27(3):82～85.