利用高效液相色谱法同时测定瘤胃液中几种水溶性维生素

赵芸君 孟庆翔

(1.中国农业大学动物科技学院肉牛研究中心，动物营养学国家重点实验室，北京 100193;2.新疆畜牧科学院饲料研究所，乌鲁木齐 830000)

水溶性维生素对反刍动物及其瘤胃微生物的正常生命活动具有重要作用，测定瘤胃液中水溶性维生素含量可为反刍动物瘤胃中水溶性维生素合成、代谢及营养相关研究提供参考。由于水溶性维生素的易被破坏性和瘤胃液中水溶性物质成分的复杂性，因而使同时测定瘤胃液中水溶性维生素成为一项难题。目前国内外反刍动物瘤胃营养研究中水溶性维生素的测定主要采用微生物法或针对一种维生素的高效液相色谱(HPLC)法，上述方法均具有繁琐、耗时且仅针对一种维生素测定等缺点。目前，在奶粉［1］、食品［2］和药物［3］等方面已开展了利用HPLC同时测定几种水溶性维生素方法的研究，而关于瘤胃液中几种水溶性维生素的同时测定仅见Aruna等［4］的报道，并且该方法存在回收率相对较低且使用了对液相色谱柱柱效及泵损害较大的离子对试剂的问题。鉴于此，在参考国内外相关文献和了解瘤胃液成分的基础上，拟对采用HPLC同时测定瘤胃液中几种水溶性维生素的方法进行摸索，旨在建立一种较为准确、实用的同时测定瘤胃液中几种水溶性维生素的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent1100型HPLC仪(美国Agilent公司);紫外检测器(美国Agilent公司);色谱柱:SBC8色谱柱，粒径 5 μm，4.6 mm ×150 mm(美国 Agilent公司);氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器公司);超纯水器(美国Millpore公司);超声波破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);AL－01溶剂过滤器(天津奥特赛恩斯仪器公司);低温离心机(美国Beckman公司);pH酸度计(上海雷磁仪器厂)。

硫胺素(标准品，99.9%)、维生素C(标准品，99.9%)、烟酸(标准品，99.9%)、烟酰胺(标准品，99.7%)、氰钴胺素(标准品，98.5%)、核黄素(标准品，99.0%)、吡哆醇(标准品，99.9%)、叶酸(标准品，98.0%)，均为美国Supelco公司产品;甲醇(色谱纯)，为美国Fisher公司产品;磷酸三钠(分析纯)，为美国Sigma公司产品;正己烷(色谱纯)、盐酸(优级纯)、碳酸钠(分析纯)和偏磷酸(分析纯)，均购于北京化学试剂公司;超纯水为Millpore超纯水机自制，电阻率18.2 MΩ。

1.2 标准液及流动相的配制

标准贮备液:准确称取维生素C、吡哆醇、烟酸、烟酰胺、氰钴胺素各10 mg于10 mL容量瓶中，用0.01 mol/L盐酸溶解并定容至刻度。准确称取5 mg核黄素于100 mL容量瓶中，用0.01 mol/L盐酸溶解并定容至刻度;准确称取5 mg叶酸于50 mL容量瓶中，用0.1 mol/L碳酸钠溶液溶解，调pH至7.0并定容至刻度。将上述标准贮备液于4℃冰箱中保存备用。维生素C标准贮备液现用现配。

标准工作液:将标准贮备液用超纯水稀释成不同浓度的混合标准液，冰箱4℃保存备用。

流动相:0.05 mol/L 磷酸三钠(pH=2.5)经溶剂过滤器抽滤后备用。流动相A为体积比为7∶93的甲醇与 0.05 mol/L 磷酸三钠(pH=2.5)混合液，流动相 B为体积比为90∶10的甲醇与0.05 mol/L磷酸三钠(pH=2.5)混合液。

1.3 瘤胃液样品的前处理

瘤胃液采用4层纱布过滤后经5 400 r/min(4℃)离心15 min，取上清液5 mL置于冰水浴中采用150 W超声破碎4 min(镜检无完整细胞)，然后加入2 mL正己烷混匀后静置分层，弃去上层取下层瘤胃液加入质量浓度为25%的偏磷酸0.6 mL，在涡旋震荡器上混匀后在冰水浴中放置30 min。经10 000 r/min(4℃)离心10 min，取上清液在40℃水浴下用氮气吹干，用0.8 mL流动相A溶解，经0.22 μm滤膜过滤上机分析测定。在操作过程中尽量避光。

1.4 色谱条件

SBC8色谱柱:粒径 5 μm，4.6 mm ×150 mm;检测波长:245 nm;20 μL定量环;柱温:室温;流速:1.0 mL/min。梯度洗脱条件:流动相 A从0 min的100%减至22 min的40%，流动相B从0 min的0升至22 min的60%。

1.5 统计方法

数据采用SAS 8.2进行t检验统计分析，显著性水平为P＜0.05。数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的筛选

2.1.1 超声破碎

瘤胃液超声破碎条件采用功率150 W，工作5 s，间隔5 s，冰水浴超声4 min后镜检无完整细胞。采用3种不同梯度浓度的标准混合工作液分别进行超声和未超声处理后进样，经t检验可知，该超声破碎条件对几种水溶性维生素的含量无显著影响(P ＞0.05)，详见表1。

2.1.2 净化和脂肪、蛋白质的去除

由于生物发酵液成分非常复杂，有许多物质会干扰维生素的测定，试验采用黄晓兰［5］报道的自制酸性氧化铝小柱。取70～100目的酸性氧化铝，湿法装填成长3～4 cm的小柱，分别用10 mL水及10 mL甲醇冲洗后，取一定量样品溶液过柱，用5%的乙酸洗脱，合并流出液和洗脱液定容后过膜测定。测定结果发现硫胺素、维生素C的分离效果不好，吡哆醇、烟酰胺、烟酸的回收率不理想，且需浓缩的体积大。用C18小柱处理［6］，可除去部分蛋白质、色素及脂类物质，但测定效果也不是很好。考虑到自制酸性氧化铝小柱和用C18小柱处理较麻烦，后参考Rizzolo等［7］的方法采用正己烷去除瘤胃液中脂肪。由于偏磷酸具有沉淀蛋白质、保护水溶性维生素和络合瘤胃液中微量金属离子的作用［8］，同时借鉴瘤胃液通常去除蛋白质的方法(加入25%的偏磷酸)［9］。试验结果表明偏磷酸对硫胺素的测定有干扰，但对其他水溶性维生素的测定无干扰，最终选偏磷酸作为蛋白质沉淀剂。

采集饲喂5种不同饲粮［高蛋白质水平全混合日粮(TMR)、中蛋白质水平TMR、低蛋白质水平TMR、青绿饲料饲粮、粗饲料饲粮］的肉牛瘤胃液，分别取5 mL(n=4)瘤胃液经超声破碎和去脂后分别添加 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 25%的偏磷酸，混匀后在冰水浴中放置30 min，然后4℃离心去除蛋白质。结果表明:添加0.6 mL 25%的偏磷酸已完全能使上述5组瘤胃液中的蛋白质发生沉淀，对硫胺素的测定有干扰，但对维生素C、吡哆醇、烟酰胺、烟酸、叶酸、核黄素、氰钴胺素的测定没有干扰。

表1 超声破碎对几种水溶性维生素含量的影响Table 1 Effects of ultrasonicdisruption on contents of several water-soluble vitamins(n=3) ng/mL

2.1.3 浓缩

通常，水溶性维生素在瘤胃液中的含量很低，且受饲喂饲粮的影响其变化幅度很大，因此瘤胃液中水溶性维生素未经浓缩时，常因含量较低而检测不到，所以本试验采用40℃水浴氮气吹干的方法浓缩瘤胃液，以便提高该方法的适用性。

2.2 色谱条件

文献报道的 HPLC 同时测定奶粉［1］、食品［2］和药物［3］中水溶性维生素的方法常采用离子对试剂，但考虑到其对色谱柱柱效及泵的损害较大，因而从实用性角度考虑应避免使用离子对试剂。测定水溶性维生素常用反相柱C18、C8，酸性的色谱条件有利于大多数水溶性维生素的稳定，且SBC8色谱柱的pH适宜范围为2～8，因此本试验选用反相 SBC8色谱柱(粒径 5 μm，4.6 mm ×150 mm)，流动相为甲醇和0.05 mol/L磷酸三钠(pH=2.5)的缓冲体系。

2.2.1 色谱条件的优化和测定水溶性维生素的种类

由于瘤胃液基体较复杂，保留时间的推迟将有利于各水溶性维生素组分的分离。流动相中甲醇含量逐渐降低，可使各水溶性维生素标准峰的保留时间逐渐推迟且各物质的分离度增加。经测定，瘤胃液样品流动相配比确定为:流动相A，甲醇与0.05 mol/L磷酸三钠(pH=2.5)的体积比为7∶93;流动相 B，甲醇与 0.05 mol/L 磷酸三钠(pH=2.5)的 体 积 比 为 90∶10;流 速 为1.0 mL/min;检测波长为245 nm。梯度洗脱条件确定为:流动相A从0 min的100%降至22 min的40%，流动相B从0 min的0升至22 min的60%。采用上述色谱条件，硫胺素、维生素C、吡哆醇、烟酰胺、烟酸、叶酸、核黄素、氰钴胺素这8种水溶性维生素标准品的色谱图见图1。

图1 水溶性维生素标准品的色谱图Fig.1 Chromatogram of water-soluble vitamin standard samples

2.3 标准液的稳定性试验

由于维生素稳定性差，对光、热、氧、酸、碱和酶等比较敏感，易于氧化分解破坏，为此在操作过程应尽量避光，样品保存在低温冰箱中尽快分析。参考文献［2］对水溶性维生素标准液稳定性进行了研究，结果发现:除叶酸用0.01 mol/L盐酸配制的标准液稳定性稍差外，其他维生素的稳定性均较好。而叶酸采用0.1 mol/L碳酸钠溶液溶解并调pH至7.0作为贮备液时，效果较好。研究发现，本试验所配制的水溶性维生素(除维生素C外)贮备液至少可稳定30d，而标准工作液除维生素C能至少稳定8 h外，其余都至少可稳定72 h。

2.4 方法考察及性能指标

2.4.1 标准曲线、线性范围及最低检出限

8种水溶性维生素的线性范围和峰面积(X)对质量浓度(Y，ng/mL)的回归方程分别为硫胺素0.5 ～ 50.0 μg/mL，Y=1.613X － 0.901 4(r=0.992 1);维生素 C 0.25 ～ 90.00 μg/mL，Y=2.132X －2.901 4(r=0.999 1);吡哆醇 0.6 ～30.0 μg/mL，Y=0.275X －0.487 6(r=0.999 9);烟酰胺0.5 ～50.0 μg/mL，Y=0.940 7X+2.839 8(r=0.999 9);烟 酸 0.5 ～ 50.0 μg/mL，Y=1.631X －7.848 1(r=0.999 3);叶 酸 0.6 ～30.0 μg/mL，Y=0.186 4X － 1.574 4(r=0.990 3); 核 黄 素 0.6 ～ 30.0 μg/mL，Y=0.685 5X －1.023 7(r=0.999 0);氰钴胺素0.2 ～50.0 μg/mL，Y=2.120 7X － 1.214 9(r=0.999 5)。按信噪比(S/N=3)计算，得出硫胺素、维生素 C、吡哆醇、烟酰胺、烟酸、叶酸、核黄素、氰钴胺素的最小检出质量浓度分别为18.21、4.81、39.40、12.90、12.00、74.11、24.00、9.57 ng/mL。

2.4.2 方法的回收率、精密度

取肉牛瘤胃液按1.3和1.4操作进行测定，发现本试验方法对瘤胃液中硫胺素、维生素C、吡哆醇未实现基线分离，因此仅对烟酰胺、烟酸、叶酸、核黄素、氰钴胺素进行瘤胃液样品加标回收率和精密度试验。

取3头肉牛的瘤胃液混匀分成多份备用，其将用于瘤胃液的本底测定、精确度试验和回收率加标试验。取其中5份分别用于测定瘤胃液中水溶性维生素的本底值，计算烟酰胺、烟酸、叶酸、核黄素、氰钴胺素的保留时间和测定值的相对标准偏差(RSD)。由表2可知，烟酰胺、烟酸、叶酸、核黄素、氰钴胺素测定值的相对标准偏差分别为2.1% 、2.3% 、8.1% 、6.5% 、3.9% ，保留时间的相对标准偏差分别为 0.24%、0.27%、0.41%、0.33%、0.36%。瘤胃液样品中水溶性维生素的色谱图见图2。

图2 瘤胃液样品中水溶性维生素的色谱图Fig.2 Chromatogram of water-soluble vitamins in rumen fluid sample

表2 精密度测定结果Table 2 Measured results of precision(n=5)

取上述3头肉牛的瘤胃液混合样品3份，分别按表3所述添加各水溶性维生素标准储备液制成高、中、低3个水平的瘤胃液样品，然后将制成的高、中、低水平的瘤胃液样品再分别分成3份，每份分别按1.3和1.4操作进行测定，扣除瘤胃液样品中空白水溶性维生素含量(即瘤胃液水溶性维生素的本底值，见表2)，计算瘤胃液样品中加标水溶性维生素的回收率、相对标准偏差。由表3可知，瘤胃液样品中加标烟酰胺、烟酸、叶酸、核黄素和氰钴胺素的平均回收率分别为97.5%、96.8%、73.2%、84.4%、89.1% ，相对标准偏差分别为 2.9% 、3.0% 、15.6% 、7.8% 、5.0% 。鉴于在本研究色谱条件下，测定瘤胃液中叶酸、核黄素和氰钴胺素时出现了基线漂移，同时参考我国国家标准许多检测方法中规定在重复条件下2次测定结果要求相对偏差小于5%，因此，确定本研究的方法仅用于测定瘤胃液中烟酰胺和烟酸的含量。

2.5 肉牛饲喂不同饲粮时瘤胃液样品的测定

选9头肉牛，分为3组，分别饲喂高精料饲粮、青绿饲料饲粮、粗饲料饲粮，采集每头肉牛的瘤胃液，分别按1.3和1.4所述测定瘤胃液中烟酰胺和烟酸含量。由表4可知，高精料饲粮组和青绿饲料饲粮组瘤胃液中烟酰胺的含量显著高于粗饲料饲粮组(P＜0.05);瘤胃液中烟酸的含量各组间差异不显著(P＞0.05)。

3 讨论

3.1 瘤胃液中水溶性维生素的测定方法

关于瘤胃液中水溶性维生素的测定方法，主要集中在针对一种水溶性维生素采用一种检测方法［10］，虽然 Aruna 等［4］对瘤胃液中烟酸、吡哆醇、硫胺素和核黄素4种水溶性维生素的同时测定方法进行了研究，但该方法使用了对液相色谱柱柱效及泵损害较大的离子对试剂且回收率较低，烟酸、吡哆醇、硫胺素和核黄素的回收率分别为84.7% ～94.4%，86.5% ～ 94.3%，84.2% ～93.8%和 80.3% ～ 90.9%。与上述方法［4］相比，本试验建立的方法采用了一种色谱条件同时完成瘤胃液中烟酰胺和烟酸的测定，且具有回收率(烟酰胺97.5%、烟酸96.8%)相对较高和未使用离子对试剂的优点。同时，本试验建立的检测方法也适用于饲粮中外源添加烟酰胺和烟酸后瘤胃液中烟酰胺、烟酸的检测。

表3 回收率测定结果Table 3 Measured results of recovery(n=3)

表4 瘤胃液中烟酰胺和烟酸的含量Table 4 Contents of niacinamide and nicotinic acid in rumen fluid(n=3) ng/mL

此外，本试验采用的色谱条件可使水溶性维生素混合标准液中的维生素C、吡哆醇、烟酰胺、烟酸、叶酸、核黄素和氰钴胺素实现较好的基线分离，由于多维添加剂成分相对简单，因此本试验采用的色谱条件可为多维添加剂中同时测定多种水溶性维生素方法的开发提供参考。

3.2 瘤胃液的前处理方法及影响瘤胃液水溶性维生素测定结果的因素分析

本试验选用偏磷酸对瘤胃液进行去蛋白质前处理干扰了硫胺素的测定，据王希希等［11］报道，甲醇可沉淀蛋白质用于测定水溶性维生素，因此今后可采用甲醇对瘤胃液进行去蛋白质处理，并考察在本试验色谱条件下对水溶性维生素测定结果的影响。本试验采用的色谱条件流速为1 mL/min时，瘤胃液中的吡哆醇未完全实现基线分离，当流速为0.9 mL/min时，也未完全实现基线分离。今后可采取降低流速或优化色谱的其他条件，使瘤胃液中的吡哆醇最终实现基线完全分离。而对于硫胺素、维生素C，需继续研究瘤胃液前处理方法以进一步净化瘤胃液，以及降低流速或优化色谱的其他条件，使瘤胃液中硫胺素、维生素C最终实现基线完全分离。

本试验采用的色谱条件测定瘤胃液中叶酸、核黄素和氰钴胺素出现了基线漂移，原因可能与流动相是梯度洗脱以及瘤胃液样品本底在检测波长有吸收有关。本试验结果表明，叶酸虽然实现了基线分离，但回收率偏低和相对标准偏差较大，原因可能与叶酸在酸性条件下易被破坏有关，也即在本试验中瘤胃液经25%的偏磷酸沉淀蛋白质后以及被溶解在pH=2.5的酸性流动相A中均受到破坏，所以本试验建立的瘤胃液前处理方法和色谱条件更适用于在酸性溶液中能稳定存在的水溶性维生素，如烟酸和烟酰胺。本试验中核黄素、氰钴胺素的回收率偏低和相对标准偏差较大，原因可能与核黄素、氰钴胺素出现了基线漂移有关，并可能与核黄素易见光分解有关。在整个检测过程中作者用锡箔纸保护尽量避光，但依旧出现核黄素回收率较低和相对标准偏差较大，更具体原因有待进一步分析。因此，为实现同时测定瘤胃液中多种水溶性维生素，需在本试验的基础上进一步优化色谱条件，解决基线漂移的问题，同时沉淀蛋白质时采用冷乙醇或甲醇，以避免酸性环境对叶酸的破坏以及个别水溶性维生素测定的干扰。另也可针对需要研究的某种特定水溶性维生素进行色谱条件优化，实现基线分离。

3.3 饲喂不同饲粮时肉牛瘤胃液中烟酰胺和烟酸含量的变化

研究表明，瘤胃中烟酸能转化成烟酰胺［12］，因此，了解瘤胃液中烟酸和烟酰胺的含量对于深入研究瘤胃的烟酸营养以及从烟酸营养的角度调控反刍动物营养代谢具有意义。本试验测定了饲喂3种不同饲粮对肉牛瘤胃液中烟酰胺和烟酸含量的影响，结果发现，高精料饲粮组和青绿饲料饲粮组瘤胃液中烟酰胺的含量显著高于粗饲料饲粮组;瘤胃液中烟酸的含量各组间差异不显著。该检测结果与Santschi等［13］报道的瘤胃液中烟酰胺和烟酸含量的数值较接近。

4 结论

本试验建立的方法相对简单，适用于同时测定瘤胃液中烟酰胺和烟酸的含量。

［1］ ALBALA H S，VECIANA N M T，IZQUIERDO P M，et al.Determination of water-soluble vitamins in infant milk by high-performance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，1997，778(1/2):247－253.

［2］ 成志强，孙成均，黎源倩.反相高效液相色谱法同时测定食品和多维片中8种水溶性维生素［J］.分析化学，2001，29(9):1068 －1071.

［3］ IVANOIC D，POPOVIC A，RADULOVIC D，et al.Reversed-phase ion-pair HPLCdetermination of some water-soluble vitamins in pharmaceuticals［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1999，18:999－1004.

［4］ ARUNA C，ANUJA D.Simultaneousdetermination of ruminal niacin，pyridoxine，thiamin and riboflavin levels by high performance liquid chromatography［J］.Indian Journal of Animal Sciences，1999，69(8):567－569.

［5］ 黄晓兰，陈云华.液相色谱法测定生物发酵液中水溶性维生素的研究［J］.分析测试学报，1997，16(3):83－85.

［6］ MORENO P，SALVADO V.Determination of eight water-and fat-soluble vitamins in multi-vitamin pharmaceutical formulations by high-performance liquid chromatography［J］.Journal ofChromatography，2000，870(2):207 －215.

［7］ RIZZOLO A，BALDO C，POLESELLO A.Application of high-performance liquid chromatography to the analysis of niacin and biotin in Italian almond cultivars［J］.Journal of Chromatography，1991，553:187 －192.

［8］ 陈骁熠.甜玉米中水溶性维生素含量的HPLC测定法及其动态变化研究［J］.湖北农业科学，2001(6):31－32.

［9］ ERWIN E S，MARCO J，EMERY E M.Volatile fatty acid analyses of blood and rumen fluid by gas chroma-tography［J］.Journal of Dairy Science，1961，44:1768－1771.

［10］ AOAC.Official methods of analysis of the association of official analytical chemists［S］.13th ed.Washington，D.C.:Association of Official Analytical Chemists，1980.

［11］ 王希希，胡燕，孙轶卓，等.反相高效液相色谱法同时测定血清中5种水溶性维生素［J］.四川大学学报，2010，41(1):158 －161.

［12］ MCDOWELL L R.Vitamins in animal and human nutrition［M］.Ames，I.A.:Iowa State University Press，2000:793.

［13］ SANTSCHI D E，CHIQUETTE J，BERTHIAUME R，et al.Effect of the forage to concentrate ratio on B-vitamin concentrations indifferent ruminal fractions ofdairy cows［J］.Canadian Journal of Animal Science，2005，85:389－399.