肉鸡饲粮中添加一水肌酸对骨骼肌肌酸吸收和代谢的影响

夏伟光 左建军 冯定远

(华南农业大学动物科学学院，广州 510642)

能量代谢是维持动物体生化和生理功能的重要代谢途径，而动物体的生化代谢与动物的生产性能密切相关，因此，通过营养手段调控动物的能量代谢来提高动物生产性能，尤其是肉品质，是目前动物营养研究的热点之一。肌酸通常可在动物的肝脏或胰腺中由精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸合成，机体中大约95%的肌酸储存在骨骼肌中。肌酸在肌酸激酶的催化作用下可转换成磷酸肌酸，而磷酸肌酸可为肌肉收缩提供直接能量来源——三磷酸腺苷(ATP)。有研究表明，在机体中肌酸以每天1.7%的分解速率进行分解［1］，在现代大规模集约化养殖条件下，快速生长的肉鸡内源合成的肌酸并不能满足自身生长的需求［2］，因此，在肉鸡饲粮中补饲肌酸对肉鸡的生长发育，尤其是骨骼肌的生长发育具有重要的潜在价值。细胞内的肌酸和经肌酸激酶磷酸化的产物磷酸肌酸共同参与ATP代谢，成为机体重要的稳定供能来源［3］。骨骼肌细胞内超过90%的肌酸是通过特异的Na+/Cl－依赖性肌酸转运载体(creatine transporter，CrT)逆浓度梯度主动吸收转运进来的，其余则由在肌酸生理浓度(20～60 mmol/L)下发生的被动吸收过程完成［4－5］。鸡的CrT mRNA序列(Gen-Bank No.JN628439.2)已经由本课题组成功克隆获得。通过补饲肌酸来改善骨骼肌的生长发育主要体现在其提高了磷酸肌酸在肌肉中的含量。在人的研究中表明，外源添加肌酸可增加骨骼肌磷酸肌酸或总肌酸的含量［6－7］。在大鼠的试验中还发现，白腓肠肌肌酸含量比红腓肠肌和比目鱼肌的高［8］，但是红腓肠肌和比目鱼肌对肌酸的吸收速率和CrT的蛋白合成量均显著高于白腓肠肌［9］，而添加肌酸只显著提高了比目鱼肌肌酸的含量［10］，这提示动物对肌酸的吸收和代谢可能与骨骼肌肌纤维类型有关。到目前为止，添加肌酸对骨骼肌生长发育的研究大多集中在人和大鼠方面，在畜禽特别是肉鸡方面鲜有报道。虽然骨骼肌具有较大的肌酸储备能力，但是摄入过多的肌酸可发生向肌酐的非酶转化过程，随后大部分肌酐通过肾脏代谢排出体外，造成添加成本的浪费。因此，本试验旨在通过研究在肉鸡基础饲粮中添加不同水平的一水肌酸(creatine monhydrate，CMH)对骨骼肌肌酸主动吸收和生化代谢的影响，以期揭示肌酸改善肉鸡骨骼肌生长发育的重要性，并为肌酸在肉鸡生产中的合理应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选用42日龄的健康雄性岭南黄羽肉鸡900只，随机分成体重［(0.73 ±0.01)kg］接近的 4 个组，每个组5个重复，每个重复45只鸡。对照组饲喂未添加CMH的基础饲粮，参照我国鸡饲养标准(2004)营养需要配制为粉状配合饲料，基础饲粮组成及营养水平见表1。试验组饲喂在基础饲粮中分别添加250、500、1 000 mg/kg CMH的试验饲粮。试验期21d。试验肉鸡为地面平养，自由采食与饮水，采用24 h光照制，按正常免疫程序进行免疫。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basaldiet(air-dry basis) %

1.2 试验材料

试验用CMH由广州百遨盛生物科技有限公司提供，分子式:C4H9N3O2·H2O，分子质量为149.15 ku，纯度为 99%。

1.3 检测指标

1.3.1 血清和骨骼肌生化指标测定

试验结束(63日龄)时从每个重复中选取4只接近平均体重的试验鸡，空腹翅静脉采血5 mL，待血液凝固后，在25℃，3 000 r/min条件下离心15 min并将血清分装待测。放血后迅速分离出胸肌和腿肌，并快速置于液氮中，后转入－80℃冰箱保存。

血清肌酸含量参照崔宝印等［11］的方法，利用肌酸与α－萘酚和双乙酰在碱性条件下显色原理直接测定。血清肌酐含量和骨骼肌中肌酸激酶的活性按照南京建成生物工程研究所试剂盒的说明书方法测定。骨骼肌肌酐和肌酸含量参考Yatzidis［12］和 Taussky［13］的方法，采用苦味酸法测定。骨骼肌磷酸腺苷含量参照Zhang等［14］的方法，利用高效液相色谱仪Waters 7500(Waters，美国)进行测定，色谱条件:固定相为Purospher STAR RP-18e色谱分析柱(Merck，德国;250 mm ×4.6 mm id，5 μm)，柱温30℃;流动相为甲醇－50 mmol/L磷酸盐缓冲液(体积比为10∶90)，用1 mol/L的 KOH溶液调 pH 至 6.5，并用 0.45 μm 微孔滤膜抽滤，流速0.8 mL/min;紫外检测波长254 nm;进样体积20 μL。

1.3.2 骨骼肌中CrT mRNA表达量的测定

采用Trizol(Invitrogen，美国)一步抽提法提取骨骼肌样品(－80℃冰箱保存)的总RNA。电泳检测:用微量加样枪吸取 2 μL总 RNA样在120 V，1.0%琼脂糖胶上，电泳20 min。纯度检测:用核酸定量仪(Eppendorf，德国)检测总RNA样品 OD值，计算 A260nm/A280nm。经 DNaseⅠ(TaKaRa，日本)消化提纯后，RNA被M-MLV反转录酶(Promega，美国)反转录成cDNA，且cDNA样品置－20℃保存。

采用实时荧光定量PCR的方法，利用MXPro 3500基因定量仪(Stratagene，美国)检测CrT、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT1)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和β－肌动蛋白(β-actin)的mRNA表达量，反应染料为SYBR@GreenⅠ(TaKaRa，日本)，反 应 体 系 为 20 μL:10 μL SYBR Green Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)，0.5 μL 上游引物，0.5 μL下游引物，1 μL cDNA 模板，超纯水补至20 μL。引物由软件 Primer Premier 6.0设计并发送到上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列及参数见表2。反应程序为:95℃预变性1 min，95℃变性15 s，在基因特异性退火温度条件下退火15 s，72℃延伸40 s，40个循环。参考Erkens等［15］的方法用 genNorm win 3.5 软件从HPRT1、GAPDH和β-actin筛选出骨骼肌中表达较为稳定的内参基因。CrT mRNA相对表达量参照Livak等［16］的方法，计算 2－ΔCt(ΔCt= 目的基因Ct－内参基因Ct)。每个样品测定3次。

表2 实时荧光定量PCR引物序列及参数Table 2 Sequences and parameters of primers for the real-time fluorescence quantitative PCR

1.4 数据统计分析

试验数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析和Student-Newman-Keuls多重比较，分别比较添加不同水平的CMH对血清和骨骼肌肌酸、肌酐含量及骨骼肌磷酸腺苷含量、肌酸激酶活性和CrT mRNA表达量的影响。P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 添加CMH对骨骼肌CrT mRNA表达量的影响

由表3可知，腿肌和胸肌CrT mRNA表达量均随着CMH添加水平的增加而提高，其中胸肌尤为明显。与对照组相比，添加500和1 000 mg/kg CMH显著上调了胸肌CrT mRNA表达量(P＜0.05)，而添加250 mg/kg CMH并未达到显著水平(P＞0.05);各CMH组之间差异不显著(P＞0.05)。与对照组相比，添加不同水平的CMH对腿肌CrT mRNA表达量没有显著影响(P＞0.05)。综上结果，表明添加不同水平的CMH可不同程度地诱导骨骼肌CrT mRNA表达量，促进骨骼肌对肌酸的吸收。

2.2 添加CMH对血清和骨骼肌肌酸生化代谢产物的影响

由表4可知，与对照组相比，添加不同水平的CMH提高了血清肌酐的含量，但没有达到显著水平(P＞0.05)。添加250 mg/kg CMH显著降低了血清中肌酸的含量(P＜0.05)，添加 500和1 000 mg/kg CMH则显著提高了血清中肌酸的含量(P＜0.05)。同时500和1 000 mg/kg CMH组的血清肌酸含量比250 mg/kg CMH组分别极显著提高了 18.0% 和 19.3%(P ＜0.01)。而各CMH组血清肌酐/肌酸与对照组相比差异均不显著(P＞0.05)，各CMH组之间也没有表现出显著性差异(P＞0.05)。这提示，添加250 mg/kg CMH可促进机体对肌酸的吸收利用，添加500和1 000 mg/kg则相反。

表3 添加不同水平的CMH对骨骼肌CrT mRNA表达量的影响Table 3 Effects ofdifferent CMH supplemental levels on CrT mRNA expression of skeletal muscle

从胸肌来看，与对照组相比，添加250、500、1 000 mg/kg CMH均极显著提高胸肌肌酸含量(P＜0.01)，不同CMH组之间差异不显著(P＞0.05);且随着CMH添加水平的增加，胸肌肌酐的含量呈现剂量依赖性上升。添加 250、500、1 000 mg/kg CMH均显著降低了胸肌的肌酐/肌酸(P ＜0.05)。

从腿肌来看，与对照组相比，肌酐含量表现出与胸肌一样的规律，即随着CMH添加水平的增加而提高。不同的是添加CMH对腿肌的肌酸含量并没有显著影响(P＞0.05)，从而导致腿肌的肌酐/肌酸随着肌酸添加水平的增加而提高，并且500和1 000mg/kgCMH组较对照组和250 mg/kg CMH组有显著的提高(P＜0.05)。

在某种程度上，这表明肌酸在腿肌中代谢效率高于胸肌，而添加250 mg/kg CMH则更有利于腿肌肌酸的储备。

2.3 添加CMH对骨骼肌肌酸激酶活性的影响

由表5可知，与对照组相比，添加不同水平的CMH对腿肌肌酸激酶活性没有显著影响(P＞0.05);但可显著提高胸肌肌酸激酶活性(P＜0.05)，提高幅度分别为 18.6%、10.0%、17.1%，各CMH组之间差异不显著(P＞0.05)。

表4 添加不同水平的CMH对肌酸生化代谢产物的影响Table 4 Effects ofdifferent CMH supplemental levels on creatine biochemical metabolites

腿肌肌酸激酶活性稍高于胸肌。肌酸激酶是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。以上结果提示，添加不同水平的CMH均可间接提高胸肌磷酸肌酸的含量，从而为肉鸡的生理生化代谢提供足够的能量储备，并以添加250 mg/kg CMH效果更为明显。

表5 添加不同水平的CMH对骨骼肌肌酸激酶活性的影响Table 5 Effects ofdifferent CMH supplemental levels on creatine kinase activity of skeletal muscle U/mg prot

2.4 添加CMH对骨骼肌磷酸腺苷含量的影响

由表6可知，与对照组相比，添加不同水平的CMH 对胸肌 ATP、ADP、AMP、TAN 含量和 EC、ATP/ADP均没有显著影响(P＞0.05)，但显著或极显著降低了AMP/ATP(P＜0.05或P＜0.01);500 mg/kg CMH组的AMP/ATP显著低于1 000 mg/kg CMH 组(P ＜0.05)，但与250 mg/kg CMH组相比差异不显著(P＞0.05)。

腿肌方面，与对照组相比，添加不同水平的CMH对其ADP含量和EC、ATP/ADP、AMP/ATP的影响未达显著水平(P＞0.05)，各CMH组之间差异不显著(P＞0.05);添加250和1 000 mg/kg CMH显著提高腿肌ATP含量(P＜0.05)，其提高幅度分别为48.4%和39.2%，但添加500 mg/kg CMH与对照组相比并没有显著影响(P＞0.05);添加不同水平的CMH对腿肌AMP含量有所提高，其中添加250 mg/kg达到显著水平(P＜0.05);同时，综合腿肌 ATP、ADP、AMP 含量的结果，发现添加 CMH均提高了其 TAN含量，且250 mg/kg CMH组比对照组显著提高了30.4%(P＜0.05)，同时高于其他 CMH组，但添加500和1 000 mg/kg CMH与对照组相比差异不显著(P ＞0.05)。

这表明，添加CMH可使胸肌的ATP合成反应加快，有利于能量的储存;同时提高腿肌TAN含量并表现出随着CMH添加水平的增加而减少的趋势。

表6 添加不同水平的CMH对骨骼肌磷酸腺苷含量的影响Table 6 Effects ofdifferent CMH supplemental levels on adenosine phosphate content of skeletal muscle μmol/mL

3 讨论

3.1 添加CMH对骨骼肌肌酸吸收的影响

机体对肌酸的吸收主要通过Na+/Cl－依赖性CrT的主动转运进行，在机体中存在2种不同亚型的肌酸转运载体CrT1和CrT2。在哺乳动物中，CrT1主要分布在能量代谢比较旺盛的组织，如心、肺、脑、肌肉、肾、脾、小肠等［17－19］;在非哺乳动物如禽类CrT1组织特异性也表现出类似的结果，并发现其在骨骼肌的 mRNA表达量最高［20］。而CrT2主要分布在睾丸并表现较为活跃［21］。骨骼肌细胞中的肌酸已被证实是通过骨骼肌中的CrT1吸收的［9，22］，通常骨骼肌中的 CrT1 也被称为 CrT。

骨骼肌对肌酸吸收的影响因素有很多，可能涉及到CrT的转录、翻译或后翻译水平的改变。但从总体上来说主要有2方面:一是通过影响CrT的磷酸化和糖基化从而影响其活性;二是通过调控CrT的表达来影响转运肌酸进入细胞内的含量。CrT分子结构中所含有的2～3个碳原子间隔开的一个羧基和一个胍基决定了其对转运底物的高度特异性［23］，不能转运肌酐、磷酸肌酸以及肌酸类似物谷氨酸、甘氨酸、3－羟基丁酸、5－羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素、γ－氨基丁酸、胆碱、牛磺酸、β － 丙氨酸等［24－25］。由于肌酸是 CrT 的特异性底物，细胞内肌酸或总肌酸含量可能影响到CrT的表达调控。Murphy等［8］的研究发现，大鼠总肌酸含量较低的比目鱼肌和红腓肠肌，其CrT蛋白含量高于总肌酸含量较高的白腓肠肌。长期补饲肌酸使大鼠后肢肌肉股四头肌的CrT蛋白表达量降低［26］。本研究发现，添加CMH对肉鸡胸肌CrT mRNA表达量的上调达到显著水平。由于肉鸡胸肌主要由酵解型的肌纤维组成［27］，因此在某种程度上可以看出添加肌酸可显著提高酵解型肌纤维组成的骨骼肌CrT mRNA表达量，以促进其对肌酸的吸收。这与前人在哺乳动物上的研究结果有一定的差异。除了存在动物种类差异的因素以外，也可能是添加肌酸对骨骼肌CrT蛋白合成的影响与mRNA有所不同。同时本研究还发现，添加CMH对腿肌CrT mRNA表达量没有显著影响，这一结果可能是由于腿肌中含有大量的肌酸，而补饲CMH对其肌酸吸收的刺激作用并不明显。所以有研究学者认为，细胞内的肌酸浓度起到了调节骨骼肌对肌酸吸收以及CrT活性和含量的作用，而这种调节作用有可能是通过激活AMP依赖性蛋白激酶(AMPK)的细胞信号通路来实现的［28］。具体的机理还有待进一步的研究。

3.2 添加CMH对骨骼肌肌酸代谢的影响

肌酸被CrT主动转运吸收进入骨骼肌细胞后，线粒体内的肌酸激酶可将其磷酸化为磷酸肌酸，当机体尤其是代谢较旺盛的骨骼肌急需要能量供应的时候，磷酸肌酸在胞浆肌酸激酶的催化作用下降解为肌酸，同时释放出可供直接利用的ATP。因此，在具有能量缓冲作用的肌酸代谢这一过程中，肌酸激酶发挥着重要的作用。有研究学者将细胞内的肌酸、磷酸肌酸以及肌酸激酶称为磷酸肌酸能量穿梭系统［29］。肌酸激酶除了参与肌酸的能量代谢过程，Meyer等［30］的研究还发现，线粒体的肌酸激酶通过ADP再利用循环机制降低了线粒体氧自由基的产生从而起到抗氧化的作用。这提示，在动物受到应激或肌肉损伤的情况下，提高肌肉的肌酸激酶活性可以作为改善肌肉生长发育的有效措施之一。Daroit等［31］研究提出，在宰后肌肉向肉转变的过程中，肌酸激酶发挥着重要的作用，因此，可以把肌肉的肌酸激酶活性作为肉品质评定的指标之一。这在一定程度上证明骨骼肌的能量代谢和肉品质具有密切的联系。本试验结果表明，添加CMH使宰后胸肌肌酸激酶活性显著提高，胸肌肌酸含量也相应地提高，显著降低了肌酐/肌酸。这可能是添加CMH增加了胸肌肌酸含量的同时也提高了高能磷酸化合物磷酸肌酸的储备。而研究表明肌肉中大量的磷酸肌酸储备对宰后延缓其糖酵解发生和pH下降具有重要的作用［32－33］。有趣的是，本研究还发现，添加 CMH 对腿肌的肌酸代谢与胸肌的情况并不一致，添加低水平(250 mg/kg)CMH对其肌酸的代谢没有显著的影响，而随着CMH添加水平的提高，腿肌肌酐含量和肌酐/肌酸比对照组显著提高，同时肌酸激酶的活性也表现出下降的趋势，由此可见，添加500和1 000 mg/kg CMH使腿肌的肌酸向肌酐转化的代谢能力增强。

磷酸腺苷(ATP、ADP和AMP)是所有生物组织内生物能量转换的高能磷酸化合物，是维持动物生命活动直接的能量来源，细胞内的能量状态取决于ATP、ADP和AMP的相对含量;EC是细胞中高能磷酸键状态的一种数量上的衡量。研究表明，骨骼肌中 ATP含量下降，ADP过量累积和AMP含量升高都会降低骨骼肌细胞的收缩速度［34－35］，因此，ATP/ADP 和 AMP/ATP 都可以用来反映肌肉是否处于疲劳或能量耗竭状态。为了进一步研究添加CMH对骨骼肌能量代谢的影响，本试验还检测了添加不同水平的CMH处理后肉鸡骨骼肌磷酸腺苷的含量。研究结果发现，添加不同水平的CMH显著降低了胸肌AMP/ATP，这表明此时骨骼肌细胞处于能量充盈的状态;添加CMH可促进胸肌的ATP合成，生成较多的ATP除了可以直接提供能量以外，还有利于ATP的储存。这与添加CMH提高肌酸含量和肌酸激酶活性以间接提高磷酸肌酸的储备结果相一致。而添加低水平(250 mg/kg)CMH可显著提高腿肌ATP、AMP和TAN含量，但添加不同水平的CMH对其EC、ATP/ADP和AMP/ATP的影响均没有显著差异，这说明添加CMH对腿肌的能量代谢没有显著影响。究其原因，一方面可能是不同部位的骨骼肌其肌纤维类型组成存在一定的差异，前人的研究结果提示肌酸含量高的肌纤维对外源肌酸的吸收转运能力弱于肌酸含量低的肌纤维，导致添加肌酸对其能量代谢的影响效果并不理想;另一方面，从其机理来看，AMPK的活性与细胞能量代谢的几种蛋白表达调控相关［36］，细胞内磷酸肌酸/肌酸下降或 AMP/ATP上升都可能激活AMPK来调节细胞的能量代谢，使细胞能量维持稳态［37－38］。Sestili等［39］在体外细胞培养的研究中发现，添加肌酸使C2C12细胞中的肌酸含量增加，磷酸肌酸含量无变化，磷酸肌酸/肌酸下降。由此推测，在饲粮中添加CMH对肉鸡骨骼肌能量代谢的影响可能与AMPK的激活有关。但是添加CMH是否对骨骼肌AMPK的活性具有调控作用还需要进一步的深入研究。在骨骼肌细胞添加肌酸培养过程中同时添加AMPK的阻断剂或激动剂处理可有助于探讨CMH对骨骼肌AMPK活性的调控。

4 结论

①本试验条件下，在肉鸡基础饲粮中连续补饲21d 不同水平(250、500、1 000 mg/kg)的 CMH可不同程度地促进骨骼肌对肌酸的吸收。

②添加低水平(250 mg/kg)的CMH更有利于增加胸肌肌酸和磷酸肌酸的储备，较好地增强肌酸代谢池的能量缓冲作用。

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