核桃油微乳液的制备及抗氧化活性研究

刘峰，催莉，耿岩玲，王晓，刘建华

(山东省分析测试中心，山东 济南 250014)

核桃油为黄色或淡黄色油脂，不饱和脂肪酸含量高达90%以上［1］，其中以油酸、亚油酸、亚麻酸为主，是一种高级营养保健油。研究发现核桃油具有降血脂、降低心血管疾病发病风险［2］，改善记忆力［3］，延缓衰老、清除自由基［4］，抗肿瘤［5］等生理活性。由于核桃油中不饱和脂肪酸含量较高，产品极易被氧化，同时，核桃油不溶于水，限制了其在食品工业中的应用。为克服上述不足，制备核桃油微胶囊是目前的主要手段［6-7］，但这些方法存在操作复杂，水溶液不稳定等缺点，因此，开发工艺简单、水介质中稳定的核桃油包封制剂，对于扩展核桃油应用领域有重要意义。

微乳液是透明或半透明的热力学稳定体系，能增溶脂溶性或水溶性物质［8］。该体系在食品、日用化工、化妆品以及石油工业等［9-12］方面有着广泛的应用。以表面活性剂为稳定剂，制备核桃油微乳液还未见报道。

本文在原有亚麻酸微乳液研究的基础上，以乙酸异戊酯为核桃油油相溶剂，选择Tween 80 和EL-35 为表面活性剂，采用拟三元相图法制备了稳定的核桃油微乳液体系，研究了体系的相行为、热稳定性、微乳液粒径和流变特性，并通过化学发光法测定了微乳液体系的抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 药品与仪器

核桃油，购自济南市历城区三川果品苗木专业合作社;聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(Tween80)、蓖麻油聚氧乙烯(35)醚(EL-35)，化学纯(BASF Co.);鲁米诺，邻苯三酚，Na2CO3，NaHCO3，浓盐酸，分析纯(中国医药集团上海化学试剂公司);水为二次蒸馏水。

ALV5000 动态光散射仪(Malvern Co.，德国);AR2000EX 流变仪(TA Co.，美国);MPI-B 型多参数化学发光分析测试系统(西安瑞迈分析仪器有限公司);DDS-II C 型数显电导率仪(上海天达仪器有限公司)。

1.2 拟三元相图的绘制

将核桃油与乙酸异戊酯按照质量比1:1 配制成混合油相。清洁干燥的试管中，按照一定比例称取定量的Tween 80，EL-35 为表面活性剂，混合油相，表面活性剂与油相的质量比由10:0 逐渐变化到0:10，室温下搅拌30 min，使其混合均匀。然后在搅拌下逐滴加水，观察并记录相态变化。记录出现相变时的水含量，在相图中标出相应的点，连接成曲线即得到相图。

1.3 电导率测量

先配制一定比例的表面活性剂相和油相的混合物(7:3，8:2，9:1)，在25 ±1℃恒温条件下搅拌均匀，逐滴加水，每次滴加后，充分搅拌约5 min 再读数，作出电导率随加水量变化曲线。

1.4 粒径及分散度测量

微乳液粒径及多分散度是考察体系稳定性及均一性的重要参数。通过测定不同浓度核桃油微乳液的粒径，考察核桃油含量对体系的影响。

1.5 流变性质测量

在相图中选择样品点，配置样品后，密封恒温放置一周。在应力控制流变仪上进行流变性能测试。锥板直径为40 mm，锥角为2°，板间距0.05 mm，测量温度为25.0 (±0.1)℃。刮去椎板周围挤出样品(避免边缘效应)后，开始测量。稳态剪切实验采用CR 模式。

1.6 O2- 清除率的测定

本实验采用鲁米诺-邻苯三酚化学发光体系，以未添加核桃油的微乳液为空白，测定不同浓度的核桃油微乳液对O2-的清除率。以0.1 mol/L，pH 值10.2 的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液配制0.2 mmol/L 鲁米诺溶液;采用10 mmol/L 的HCl 溶液配制10 mmol/L 邻苯三酚溶液。在样品池中依次加入鲁米诺溶液4 mL、样品(或空白)溶液0.2 mL、邻苯三酚溶液0.4 mL，记录其在400 s 内的发光强度，以曲线积分面积表示相对发光强度，清除率计算公式如下:

其中，I0、I 分别为空白和核桃油微乳液样品的相对发光强度。计算清除率在50%时的核桃油浓度IC50。

2 结果与讨论

2.1 核桃油微乳液相图

图1 是核桃油微乳液体系的拟三元相图，其中，EL-35 与Tween 80 质量比为8:2，核桃油与乙酸异戊酯质量比为1:1。相图内可得到5 个相区:其中2Φ 相为乳状液;L2相为W/O 微乳液;LC 为液晶相;B.C.为双连续相;O/W 相为O/W 微乳液，油相最大增溶量为9%。各相区的区分由电导率法和偏光显微镜法测得。

2.2 电导率法区分微乳液类型

电导率法是划分微乳液类型的一个常用方法［13］。图2 为油相与表面活性剂相质量比2:8 时，体系电导率随水的质量分数增加的变化曲线。由于水在质量分数58% (b 点)之前体系为液晶相(由偏光显微镜观察判断)，因此，电导率测量由水的质量分数为58%时开始。随着体系中水的质量分数的增加，电导率开始是非线性较缓慢的增加，这说明体系处于双连续微乳结构(B.C.)，当水质量分数达到73%(c 点)时，溶液的电导率达到最大值。随着含水量的继续增大，电导率下降，此时双连续微乳结构已全部转变为小的油滴分散至水介质中，形成O/W 型微乳液。含水量的增大使得微乳液滴的浓度降低，致使电导率下降。

同样方法，测得其余油相与表面活性剂相质量比的电导率变化，判断体系B.C.与O/W 相，相区划分如图1 所示。

图1 核桃油微乳液体系的拟三元相图Fig.1 Pseudo-ternary phase diagram of a walnut oli microemulsion system

2.3 温度对微乳液的影响

随着温度的变化，微乳液可能会发生相转变，因此测量体系在不同温度下的稳定性，对微乳液体系的应用、储藏有重要意义。微乳液样品(B、C、D 各组分含量见表1)电导率随温度的变化，如图3 所示。微乳液中导电粒子为O/W 型微乳液，温度升高，微乳球之间的碰撞变频繁，电导率上升。在实验温度范围内，微乳液体系澄清透明，无混浊生成，电导率基本呈线形上升，说明在此温度范围内，微乳液类型保持不变。一般货品应用、储藏温度不会高于60℃，因此，该微乳液样品在储藏温度范围内不会发生相转变。

2.4 O/W 微乳液的粒径及稳定性

固定表面活性剂相(Saa)与水相的质量比，考察体系O/W 微乳液的粒径(Rh)及多分散度(PDI)随油相加入的变化，通过动态光散射的方法进行了表征，结果见表1。

表1 不同油相含量的微乳液粒径及多分散度Table 1 Mean hydrodynamic diameter(Rh)and polydispersity index (PDI)of O/W microemulsions of different oil contents

如表1 所示，微乳液的粒径随油相的增加而明显增大。这是因为样品A 中无油相，仅仅是表面活性剂的胶束溶液，随着油相的加入，表面活性剂单分子层变松，曲率变小，油相进入胶束内核或栅栏层，形成O/W 型微乳液，从而使粒径增大。同时，微乳液体系多分散度也随着油相的加入而增大，说明体系混乱度增加，在自发体系中，有的微乳液包封了较多油相，而有的则包封较少，致使粒径分布不均。

2.5 微乳液流变特性

流变学的研究有助于了解溶液、溶胶等流体类型，对微乳液的应用有重要意义。图4(a)是微乳液样品B、C、D 表观粘度(η)在不同剪切速率(˙γ)下的变化曲线，样品粘度表现为剪切变稀行为。中等剪切速率下，微乳液的流动曲线可用Ostwald de Waele 模型［14］(幂律模型):

式中K 为稠度系数，n 为流体特性指标，表示与牛顿流体偏离的程度，n=1 时为牛顿流体，n ＜1 时为拟塑性流体。

对上述公式两边取对数，可得:

图4 微乳液粘度随剪切速率的变化Fig.4 Variation of microemulsion viscosity with the shear rate

表2 微乳液幂律模型中的n，K 值Table 2 n and K values for microemulsion samples

图4(b)为微乳液lg η 随lg ˙γ 的变化曲线，将数据进行线性拟合，可求得K，n 值，结果见表2。样品中n都小于1，说明体系属于拟塑性流体，剪切过程，可使流体组织排列更加有序，有利于延长或改善功能因子或药物的缓释时间。

2.6 核桃油微乳液对O2- 的清除作用

如图5(a)所示，核桃油在微乳液体系内对O-2有明显的清除作用，清除率随核桃油浓度的增加而增大，当核桃油浓度为0.506 mg/mL时，清除率达到82.54%。同时，在微乳液体系中O-2清除率与核桃油的浓度在一定范围内(0.010～0.169 mg/mL)成线性关系，如图5(b)。在此浓度范围内对清除率进行线性拟合，得回归方程y=19.360 +339.273x (R2=0.989)，IC50值为0.090 3 mg/mL。

图5 核桃油微乳液对O2-的清除作用Fig.5 Scavenging activity of walnut oil microemulsion on superoxide anion

3 结论

通过拟三元相图法，在无助表面活性剂的条件下，制备了核桃油O/W型微乳液。结果显示，该微乳液具有良好的热稳定性;微乳液粒径随核桃油含量的增加而增大;稳态剪切扫描显示，微乳液剪切变稀，为拟塑性流体;核桃油在微乳液内对O-2有较强的清除作用。本研究为核桃油功能性制剂的进一步研究和开发打下了良好的基础。

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