HPLC-DAD法同时测定附子中5种水溶性成分

唐小龙， 黄志芳， 陈 燕， 刘玉红， 刘云华， 赵军宁， 易进海*

(1.成都中医药大学，四川成都 610072;2.四川省中医药科学院，四川成都 610041)

附子为毛莨科植物乌头Aconitum carmichaeliDebx.子根的加工品，为有毒中药的代表，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛的功效［1］。附子中水溶性成分量微、不易检测，其主要成分有去甲猪毛菜碱 (salsolinol)、去甲乌药碱 (demethylcoclanrinhihenamine)、棍掌碱 (coryneine)、氯化甲基多巴胺 (coryneine chloride)、尿嘧啶 (uracil)等，均具有强心作用，其中，氯化甲基多巴胺和去甲猪毛菜碱还具有升压作用［2－6］。但目前尚未见文献报道附子水溶性成分的定量测定，本实验首次建立了HPLC-DAD法同时测定附子中盐酸多巴胺、去甲猪毛菜碱、尿嘧啶、尿苷、鸟苷，该方法准确、快速，为附子质量控制提供新的参考方法。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪系列 (美国安捷伦科技公司，包括四元泵，DAD检测器，柱温箱，自动进样器，工作站);KQ－100超声波清洗仪 (昆山市超声仪器有限公司);AUW220D型十万分之一电子天平 (日本岛津);Sigma3K15高速冷冻离心机 (德国Sigma);Millipore Milli-Q Integral 3超纯水机 (美国密理博)。甲醇为美国Fisher色谱纯;水为超纯水;其余试剂均为分析纯。

对照品尿嘧啶 (批号:100469-200401)、盐酸多巴胺 (批号:100070-200405)、尿苷 (批号:887-200202)购自中国药品生物制品检定所;鸟苷(批号:10111132)购自上海同田生物技术有限公司;去甲猪毛菜碱对照品由本实验室从附子中分得，其纯度为98.2%，经理化性质和光谱数据分析，鉴定其结构。

生附子采自四川江油等地，其他实验样品购于成都荷花池药材市场，由四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定为毛莨科多年生草本植物乌头Aconitum carmichaeliDebx.的子根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Phenomenex Luna 5u PFP(2)100R色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为0.1%磷酸-甲醇，梯度洗脱 (0～30 min，100∶0→87∶13);体积流量1.0 mL/min;检测波长为260 nm(尿嘧啶，尿苷，鸟苷)和280 nm(盐酸多巴胺，去甲猪毛菜碱);柱温35℃;进样量10～50 μL;对照品溶液及供试品溶液的色谱图见图1。

图1 对照品 (A)和附子药材 (B)HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

2.2 对照品溶液的制备 取尿嘧啶、盐酸多巴胺、去甲猪毛菜碱、尿苷、鸟苷对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含尿嘧啶0.022 mg、盐酸多巴胺0.026 mg、去甲猪毛菜碱 0.026 mg、尿苷0.055 mg、鸟苷0.037 mg的混合对照品溶液Ⅰ。精密吸取上述混合对照品溶液1 mL，加水溶液稀释至10 mL，摇匀，即得混合对照品溶液Ⅱ。

2.3 供试品溶液的制备 取附子粉末 (过三号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.05 mol/L盐酸25 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用0.05 mol/L盐酸补足减失的质量，摇匀，高速离心 (12 000 r/min)5 min，取上清液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系 精密吸取2.2项下混合对照品溶液Ⅰ5、10、15、20 μL和混合对照品溶液Ⅱ2、5、10、15、20 μL，注入液相色谱仪中，以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得到尿嘧啶的回归方程Y=5.13×103X+2.62，r=0.999 9;盐酸多巴胺的回归方程Y=8.58×102X－9.21，r=0.999 9;去甲猪毛菜碱的回归方程Y=8.52×102X－9.07，r=0.999 9;尿苷的回归方程Y=2.62×103X+4.24，r=0.999 9;鸟苷的回归方程Y=2.68×103X+6.01，r=0.999 9。结果表明，尿嘧啶，盐酸多巴胺，去甲猪毛菜碱，尿苷和鸟苷进样量分别在 0.004 4～0.44 μg，0.005 2 ～0.52 μg，0.005 2 ～ 0.52 μg，0.010 9 ～1.09 μg和0.007 3 ～0.73 μg范围内线性关系良好。

2.4.2 检测限与定量限 在选定的色谱条件下，当信噪比为3时，测得尿嘧啶的检测限为0.22 ng，盐酸多巴胺的检测限为2.35 ng;去甲猪毛菜碱的检测限为2.63 ng，尿苷的检测限为0.55 ng和鸟苷的检测限为0.37 ng;当信噪比为10时，测得尿嘧啶的定量限为0.71 ng，盐酸多巴胺的定量限为5.73 ng;去甲猪毛菜碱的定量限为7.87 ng，尿苷的定量限为1.09 ng和鸟苷的定量限为1.46 ng。

2.4.3 精密度试验 精密吸取供试品溶液 (S1)50 μL，连续进样6次，记录峰面积，尿嘧啶，盐酸多巴胺，去甲猪毛菜碱，尿苷和鸟苷的RSD分别 为 0.66%，0.91%，0.50%，0.53%， 和0.74%，表明仪器精密度好。

2.4.4 重复性试验 取附子粉末 (S1)6份，按2.3项下制成供试品溶液，精密吸取供试品溶液各50 μL，注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进行检测，记录峰面积，计算。尿嘧啶的平均质量分数为9.4×10－3mg/g(RSD=1.41%);盐酸多巴胺的平均质量分数为 8.7×10－2mg/g(RSD=1.16%);去甲猪毛菜碱的平均质量分数为1.3 mg/g(RSD=0.84%);尿苷的平均质量分数为2.9×10－1mg/g(RSD=1.12%);鸟苷的平均质量分数为1.7×10－1mg/g(RSD=0.95%)(n=6)。

2.4.5 稳定性试验 取同一供试品溶液 (S1)于0、1、2、4、8、24 h进样测定，尿嘧啶、盐酸多巴胺、去甲猪毛菜碱、尿苷和鸟苷峰面积的RSD分别 为 0.93%、0.80%、0.70%、0.56% 和0.80%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.6 回收率试验 取已知含有量的附子粉末(S1)6份，精密称取约0.5 g，分别精密加入一定量的尿嘧啶、盐酸多巴胺、去甲猪毛菜碱、尿苷和鸟苷对照品，按2.3项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算加样回收率。尿嘧啶的平均回收率为98.76%(RSD=1.86%);盐酸多巴胺的平均回收率为102.59%(RSD=1.37%);去甲猪毛菜碱的平均回收率为101.68%(RSD=0.80%);尿苷的平均回收率为100.06%(RSD=0.51%);鸟苷的平均回收率为102.24%(RSD=0.78%)(n=6)。

2.4.7 样品测定 取附子样品，分别按2.3项下方法制成供试品溶液，依法测定，计算尿嘧啶、盐酸多巴胺、去甲猪毛菜碱、尿苷、鸟苷的质量分数，结果见表1。

表1 附子药材测定结果Tab.1 Determination results of samples

3 讨论

3.1 流动相的选择 参考文献方法［7-10］，本实验经进一步优化，最终确定流动相为0.1%磷酸-甲醇，梯度洗脱，在此色谱条件下，样品中尿嘧啶、盐酸多巴胺、去甲猪毛菜碱、尿苷和鸟苷与其它色谱峰分离良好，且与对照品DAD光谱一致。本实验还比较了十八烷基硅烷键合硅胶柱 (Eclipse XDB C18，Phenomenex Luna C18)和五氟苯基柱(Phenomenex Luna PFP)，结果显示五氟苯基柱分离效果更佳。

3.2 检测波长的选择 采用二极管阵列检测器考察了尿嘧啶、盐酸多巴胺、去甲猪毛菜碱、尿苷和鸟苷的DAD光谱，结果显示:核苷类成分尿嘧啶、尿苷和鸟苷在260 nm有最大吸收，盐酸多巴胺和去甲猪毛菜碱在280 nm有最大吸收，故分别选择260 nm和280 nm作为检测波长。

3.3 提取方法的考察 本实验考察了水、酸水、30%甲醇、50%甲醇、30%甲醇 (含0.45%盐酸)和50%甲醇 (含0.45%盐酸)对提取效果的影响，结果表明以酸水提取效果最佳;对酸水浓度(0.025、0.05、0.1、0.2 mol/L)进行了考察，表明对测定结果无明显影响，故本实验用0.05 mol/L盐酸溶液提取。此外，还比较了回流与超声对提取效果的影响，结果表明二者无明显差异，故选择简便的超声提取。

3.4 结果分析 本实验建立了HPLC-DAD法同时测定附子中5种水溶性成分，方法简便可行。结果显示，不同来源的生附子及炮制品中5种水溶性成分的量差异较大，从总体趋势来看，生附子水溶性成分的含有量明显高于炮制品，表明附子产地及其加工炮制对水溶性成分有显著影响，炮制对附子水溶性成分损失严重，部分炮制品中水溶性成分已检不出。附子水溶性成分具有显著的强心和升压作用，因此，有必要测定其代表性主要成分，才能更好地反应、控制附子的质量和有效性。本实验为附子炮制及其质量控制提供了新的参考方法。

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