采用Y型神经导管修复大鼠骶1神经缺损

孙秀艳，孙 博，李航旭，胡志元，王 辉，张晓毅

1第二炮兵总医院 泌尿外科，北京 100088；2辽宁医学院附属第三医院 泌尿外科，辽宁锦州 121000

自体神经移植修复，存在可供移植神经来源有限，移植神经直径与受体神经不匹配，供区神经功能丧失以及神经瘤形成等诸多弊端。因此，寻找不损害自身，能随神经缺损长度及粗细裁剪，修复效果肯定的自体神经移植替代品，成为基础和临床工作者们不断追求的目标[1]。可降解人工合成材料聚碳酸亚丙酯(poly propylene carbonate，PPC)是用二氧化碳和环氧丙烷合成的交替共聚物，将其与天然生物材料I型胶原(collagen typeⅠ，COL-Ⅰ)复合使用制作出的神经导管，既具有PPC的良好力学性能，又能促进细胞黏附与增殖，是一类具有良好应用前景的组织工程支架材料[2-3]。

材料和方法

1 实验动物和设备 健康雄性Wistar大鼠20只，8周龄，体质量(250±20) g，由解放军总医院实验动物中心提供。CE1900型冰冻切片机(Leica公司，德国)，便携式肌电图仪(Medtronic Keypoint公司，丹麦)，Apollo 300扫描电镜(CamScan公司，英国)，BIO-LINK BLX紫外交联仪(Vilber公司，法国)，BH-2型OLYMPUS生物显微镜(OLYMPUS公司，日本)，PPC(清华大学)。

2 Y型神经导管的制备 以氯仿为溶剂，配制浓度为0.1 g/ml的PPC溶液，使其在电压为15 kV、喷丝头与接收转桶的间距为6 cm、流速为0.4 ml/h的条件下进行静电纺丝，收集、干燥后获得PPC支架。将Ⅰ型胶原溶于0.2 mol/L乙酸搅拌至完全溶解。配成10 g/L胶原溶液，离心除泡。将配成的溶液注入PPC制作的Y型神经导管内(图1)。放入-20℃冰箱中，过夜。然后将神经导管置于-80℃冻干机内冻干48 h，取出后放进紫外线交联仪中交联30 min；经过紫外线交联后置于PBS液浸泡12 h并冲洗3~5遍。用60Co辐照消毒，无菌保存[4-5]。

3 动物模型制备及分组 取20只实验动物，随机分为2组，每组10只。用10%水合氯醛注射液腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后，取俯卧位，于L5-S4处为手术切口，分离出右侧S1神经主干，切断主干，造成近端主干与远端分支间距达2 mm。导管组：用2 mm长Y型神经导管桥接S1神经缺损，分别用11-0缝合线将神经导管与S1神经主干缝合，使神经残端套入管内各1 mm，逐层关闭切口。自体神经组：以自体神经代替神经导管，将自体神经原位缝合至各断端，其余过程同导管组(图2)。

4 电生理检测 术后2周，实验动物以10%水合氯醛注射液，腹腔注射麻醉后，取背部切口，显露术侧及正常侧S1神经主干，行尿道运动诱发电位测定。刺激电极置于右侧S1神经主干吻合口近侧，记录电极刺入尿道。电刺激参数：1.0 mA、0.1 ms、1.0 Hz，测量诱发电位潜伏期及波幅。

5 组织学观察 完成电生理测定后处死动物，取材吻合口附近神经，纵向冰冻切片，行NF-200免疫组织化学染色。观察吻合口处神经连续性情况。Y型神经导管NF-200免疫组织化学染色方法神经冰冻切片后室温放置30 min，于纯丙酮溶液中固定10 min，用PBS液冲洗(pH=7.4，0.01mol/L)5 min×3次。3% H2O2溶液中孵育5 min，用PBS液冲洗5 min×3次。切片中滴加NF-200鼠抗人一抗(1∶200稀释)，4℃过夜。用PBS液冲洗5 min×3次。切片中滴加TRITC(1∶100)(红色)标记山羊抗小鼠二抗IgG，避光保存40 min。用PBS液冲洗5 min×3次，甘油封片，荧光显微镜下观察[6-7]。

图1 静电纺丝装置示意图

图2 导管桥接修复手术示意图

结 果

1 神经导管形貌 大体观，导管外观呈Y型，质地均匀一致，管内填充物呈海绵状(图3)。扫描电镜观察神经导管纵切面，可见管内COL-I分布较为均匀(图4)。

2 大体观察 实验动物手术部位无红肿现象发生，切口愈合良好，无死亡，饮食正常。

3 电生理检测 电极刺激S1神经主干吻合口近端。自体神经组可于尿道处记录到运动诱发电位：潜伏期为(2.75±0.72) ms，波幅(2.35±0.83) mv。导管组记录到运动诱发电位潜伏期为(1.34±0.56) ms，波幅(6.21±0.44) mv。见图5、图6。

4 组织学观察 神经吻合口处连续性良好，吻合口周围无粘连。NF-200染色显示，S1神经主干神经纤维再生长入移植段近端吻合口。自体神经组可见轴突均已长入移植段远端吻合口(图7左)，导管组可见轴突均已长入移植段远端吻合口(图7右)。

图3 Y型神经导管的大体观察

图4 扫描电镜观察，可见管内COL-I分布较为均匀(标尺长度=500 μm)

图5 肌电图

图6 两组肌电图波幅潜伏期比较

图7 神经NF-200染色(×50)

讨 论

神经导管由天然或人工合成材料制成，具有特定的三维结构和生物活性，用于修复神经缺损，具有黏附支持细胞、引导轴突再生、保持轴突再生所需要的神经生长因子浓度等优点，因此可达到引导和促进神经再生的目的。但是制作、合成神经导管的材料需要具有安全性、组织相容性、可降解性、渗透性、合适的弹性和机械强度等[8-10]。

PPC是脂肪族聚碳酸酯，由二氧化碳和环氧丙烷交替共聚而成，能完全生物降解，在自然条件下，PPC无定型结构，接近人体温度或在人体内时，具有良好的韧性[5]。PPC玻璃化温度较低，而且不易加工成型，但具有较低的弹性模量及较高的断裂伸长率，已有研究将其与PLA、PHBV等生物医用材料共混来改善这些材料的生物力学性能[9]。而且，有研究表明PPC与骨髓基质细胞有较好的亲和性[11]。COL-I是胶原蛋白，目前组织工程学研究中COL-I是最为常用的天然生物材料之一，具有多方面的生物活性，不仅是组织支持物，而且还是细胞外间质的重要成分。COL-I可以促进细胞黏附及诱导生长分化，是良好的培养黏附剂，其降解产物能被细胞利用合成新的基质，不会产生毒性代谢产物，也不影响内环境pH值。本研究过程中，该导管降解时间为半年。2周取材时，神经导管周围组织正常，未见神经水肿、导管降解等不良反应。以上结果表明，PPC复合COL-I神经导管具有良好的生物相容性。

总之，本研究中的PPC复合COL-I神经导管修复大鼠S1神经缺损研究结果表明，该神经导管对S1神经这种特殊部位的神经缺损有着良好的桥梁作用和促神经再生作用。为临床修复神经缺损提供了新的途径。

1 De Filippo RE，Yoo JJ，Atala A. Urethral replacement using cell seeded tubularized collagen matrices［J］. J Urol，2002，168（4 Pt 2）：1789-1792.

2 Figallo E，Flaibani M，Zavan B，et al. Micropatterned biopolymer 3D scaffold for static and dynamic culture of human fibroblasts［J］.Biotechnol Prog，2011，23（1）：210-216.

3 Wang SM，Tsai HP，Huang JJ，et al. Inhibition of nitric oxide synthase promotes facial axonal regeneration following neurorrhaphy［J］. Exp Neurol，2009，216（2）：499-510.

4 Staack A，Hayward SW，Baskin LS，et al. Molecular，cellular and developmental biology of urothelium as a basis of bladder regeneration［J］. Differentiation，2005，73（4）：121-133.

5 Campodonico F，Benelli R，Michelazzi A，et al. Bladder cell culture on small intestinal submucosa as bioscaffold：experimental study on engineered urothelial grafts［J］. Eur Urol，2004，46（4）：531-537.

6 Niu YS，Zhang WX，Li HC，et al. Carbon dioxide/propylene oxide coupling reaction catalyzed by chromium salen complexes［J］.Polymer，2009，50（2）：441-446.

7 Wang JT，Zhu Q，Lu XL，et al. ZnGA-MMTcatalyzed the copolymerization of carbondioxide with propyleneoxide［J］. Eur Polym J，41（5）：1108-1114.

8 周喜，杨先贵，陈彤，等. 以二氧化碳和邻氯丙醇为原料合成碳酸丙烯酯［J］. 催化学报，2009，30（1）：7-8.

9 Wang XL，Li RKY，Cao YX，et al. Essentialwork of fractureanalysis for starchfilled poly（propylene carbonate） composites［J］.Materials & Design，2007，28（6）：1934-1939.

10 Du LC，Meng YZ，Wang SJ，et al. Synthesis and degradation behavior of poly（propylene carbonate） derived from carbon dioxide and propylene oxide［J］. J Appl Poly Sci，2004，92（3）：1840-1846.

11 Bartsch G Jr，Atala A. Tissue engineering in urology. Basic principles and application［J］. Urologe A，2003，42（3）：354-365.