骨蚀宁Ⅰ号胶囊对激素性股骨头缺血性坏死TGF－β1表达的影响

李文君 周正新

1.安徽省六安市中医院，安徽 六安 237006;2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031

激素性股骨头缺血性坏死 (Steriod－induced avascular necrosis of femoral head简称SANFH)是指因为大剂量应用激素而造成股骨头骨的活成份 (骨细胞、骨髓造血细胞和脂肪细胞)死亡所引起的病理过程。中医药疗法在早期防治激素性股骨头缺血性坏死方面具有一定的优势。本研究通过实验探讨中药骨蚀宁Ⅰ号胶囊对实验SANFH兔TGF－β1表达的影响，为骨蚀宁Ⅰ号胶囊在临床上进一步推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康8月龄的SPF级长耳新西兰大白兔40只，体重 (2.0±0.5)㎏，雌雄兼备，雌性21只，雄性19只，均由安徽医科大学动物实验中心提供。实验前常规适应性喂养2周。按随机数字表法分为正常组 (n=4)、骨蚀宁胶囊组 (n=12)、模型组 (n=12)和仙灵骨葆对照组 (n=12)。实验中对动物的处置均符合中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》[1]。实验地点为安徽医科大学动物实验中心及安徽中医药大学第一附属医院病理科。

1.2 建立SANFH动物模型 采用安徽医科大学实验动物中心提供健康8月龄长耳新西兰大白兔40只，体重 (2.0±0.5)kg/只，雌雄兼用，SPF级。实验动物自由摄食、饮水，室温控制在22～25℃。随机选取4只为正常组，余36只用于造模;每间隔24h于兔耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素，每次50μg/kg，共注射2次，并于第二次注射内毒素24h后肌肉内注射甲基强的松龙20mg/(kg·d)，连续注射3d，每次间隔24h。所有实验动物每周臀部注射青霉素20万U，预防感染。制备成典型的骨坏死动物模型。

1.3 给药方法 造模后将各组置于同等条件下喂养，根据实验动物用药换算公式 (Db=Da*Rb/Ra*(Wa/Wb)1/3(其中Db为兔子公斤体重剂量，Da为成人公斤体重剂量，Rb、Ra为体型系数，分别等于0.093、0.1，Wb、Wa为已知动物体重，兔子体重按照平均体重2kg计算，成人体重按照标准体重60kg计算，即Db=0.47g)计算给药量，按以上公式分别计算出，骨蚀宁组1.41g/kg·d(按体表面积计算，相当于成人服骨蚀宁Ⅰ号方每天用量10g的3倍);对照组药用仙灵骨葆按1.92g/kg·d(相当于成人每天总量的13.5g/d的3倍)灌服。各用药组将药物用蒸馏水配成药液15ml灌胃，模型组用生理盐水15ml灌胃，每日灌胃一次。

1.4 标本采集 各组实验动物分别于第8周取出股骨头，取股骨头前禁食、水12小时。耳缘静脉注射空气处死动物，取出右侧股骨头，将全部股骨头负重区沿冠状面剖开，软骨下区切取1.0 mm×1.5 mm×1.0mm组织，进行观察和检测。

1.5 检测指标和方法 标本常规HE染色，TGF－β1采用免疫组化分析法进行检测，石蜡切片 (Leica RM2135，厚度4微米)置入10%中性甲醛中固定，取EDTA200g，加入1000ml双蒸水，搅拌，制成脱钙液，保持恒温25～28℃，浸泡约3～4周，每隔3天更换脱钙液，以针顺利刺入骨头无阻力为脱钙终点，然后逐级酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后进行连续切片，TGF－β1免疫组化染色封片后，在荧光显微镜10×40倍的镜下进行观察，在最大清晰度、最小灰度、最低的失真度下对阳性表达最明显之处进行数码摄片，每张标本片分别摄片三次，把摄得的照片输入电脑，用捷达DP－801分析系统软件进行TGF－β1的平均光密度进行分析得到数据，把同一张标本片的三张照片所分析得到的数值进行求平均值即为该标本的一个原始数据，把得到的所有数据进行统计分析。

2 结果

第8周模型组家兔与同期对照组、骨蚀宁组TGF－β1表达比较，有统计学差异 (P＜0.05)。(见下表1)

表1 不同组间TGF－β1免疫组化平均光密度统计分析 (±s，n=12)

表1 不同组间TGF－β1免疫组化平均光密度统计分析 (±s，n=12)

注:与对照比较，*P＜0.05;与骨蚀宁组比较#P＜0.05。

组别 第8周0.4719±0.01007对照组 0.5034±0.01600骨蚀宁组 0.5640±0.00743模型组 0.2344±0.14 168*#正常组

3 讨论

骨蚀宁胶囊是安徽中医院大学丁锷教授在长期治疗SANFH的临床实践中，遵循《黄帝内经》:“结者散之，留者攻之”的理念，推广“活血、祛瘀、生新”的治疗原则，提出了以活血化瘀、补肾壮骨的基本治则[2]。丁教授认为股骨头的生理、解剖特点和股骨头坏死的病机特点，决定了其所形成的“瘀血”并不同于一般的病症，常规活血化瘀药物难以直达病所，只有配合虫类药物才能剔刮深达筋骨之瘀血与痰浊。在此基础上，再结合临床治疗脱疽有效药物的实践，研制骨蚀宁Ⅰ号方，由穿山甲20g、当归30g、川芎20g、蜈蚣20g、全蝎20g、土鳖虫25g、地龙30g、水蛭30g、肉桂10g、姜黄30g、冰片6g组成，共收破瘀通络之功。

TGF－β是一组具有多功能性蛋白多肽，对多种结缔组织具有复杂生物效应的生长因子，其主要来源于淋巴细胞、血小板、巨噬细胞等。尤以在血小板和骨组织含量最为丰富，TGF－β的生物学作用非常广泛，可以促进各类软组织损伤修复、促进血管生长[3－4];参与体内许多炎症反应及组织修复;并参与骨与软骨的形成。有研究表明TGF－β1在软骨形成过程中起着重要的调节作用[5]。TGF－β在骨修复中所表现的作用体现为对破骨细胞、成骨细胞、软骨细胞的代谢调节。TGF－β对细胞代谢调节的作用表现为双向效应，其既能刺激细胞增殖分化，也能对其抑制。如果周围环境比如细胞群分化状态及生长条件不同，则TGF－β对细胞群的作用就显著不同，但一般来说，低浓度TGF－β起刺激作用，高浓度时起抑制作用。对成骨细胞代谢调节则表现为促进合成Ⅰ型胶原、骨桥蛋白和骨粘连素。此外，TGF－β还可能通过下列2种途径从而促进细胞外基质合成:①刺激成纤维细胞和成骨细胞中蛋白酶抑制剂的产生(譬如纤维蛋白溶酶原活化剂的抑制剂);②抑制成骨细胞中蛋白酶的产生以及抑制成纤维细胞中琉基酶和金属蛋白的产生。基于对细胞外基质合成的有明显促进作用，认为TGF－β在创伤愈合、新骨形成、骨组织的修复及重建过程中起重要作用。

短期内大剂量应用激素造成股骨头区血液供应中断，局部出现缺血，致使骨的活性成份坏死。有研究表明，在股骨头坏死的不同阶段，组织匀浆TGF－β的表达情况不同，且随着病情的增加，TGF－β的表达量逐渐减少[6]。骨缺血坏死后随着机体对坏死区修复的激活，修复细胞产生TGF－β1的量逐渐增多。本研究显示给予激素性股骨头缺血坏死实验兔骨蚀宁治疗后，股骨头局部TGF－β1的表达上调;模型组TGF－β1的表达显著降低，表达趋势恰好相反。表明骨蚀宁胶囊可以促进激素性股骨头缺血坏死模型兔股骨头局部TGF－β1的表达。组间比较，有统计学差异，骨蚀宁组作用显著。表明骨蚀宁胶囊可促进激素性股骨头缺血坏死模兔股骨头局部TGF－β1的表达，从而促进坏死股骨头的修复。

[1]Yonenobu k.The ministry of science and technology of the People，s republic of China [J].Guidance suggestions for the gare and use of Laboratory animal，2006－09－30.

[2]周正新，刘安平，周章武，等.辩证应用骨蚀宁Ⅰ号Ⅱ号方治疗股骨头缺血性坏死76例临床观察[J].中医药临床杂志，2011，23(1):38－39.

[3]PEPPER，M S.Transforming growth factor －beta:vasculogenesis，angiogenesis，and vessel wall Integrity [J].Cytokine Growth Factor Reviews，1997，8(1):21－43.

[4]DARLAND D C，D＇AMORE P A.Blood vessel maturation:Vascular development comes of age[J].Journal of Clincal Investigation，1999，103(2):157－158.

[5]Bai XW，Xiao ZF，Pan YQ，et a1.Cartilage－derived morphogenetic Protein－ 1 promotes the differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes.Biochem Biophys Res Commun，2004，325(2):453－460.

[6]崔凤金.不同分期股骨头坏死组织TGF－β的表达[J].广州医学院学报，2012，40(4):27－29.