西部马脑脊髓炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法建立及标准质控品制备

谷 强，吴亚琼，高志强，刘 环，张 伟，蒲 静，乔彩霞，张鹤晓，吴清民

（1. 中国农业大学 动物医学院，北京 100094；2. 北京出入 境检验检疫局，北京 100026）

西部马脑脊髓炎病毒（western equine encephalitis virus， WEEV）为披膜病毒科甲病毒属成员，可引起人和的发病，病马常呈亚临床感染，病症相对温和，感染马的致死率低于30%。该病潜伏期5～14d，临床症状包括发热、厌食和精神高度沉郁。严重时，病马表现为狂躁不安、失明、共济失调、精神极度沉郁、卧地不起、痉挛，最后可导致死亡。人感染本病毒后，患者表现为高热，头痛，痉挛，呕吐和嗜睡，有的迅速发展为昏迷状态而死亡。WEEV对人的致死率为明显低于东部马脑脊髓炎病毒[1-2]。我国于1990年分别从新疆乌苏县的一组赫坎按蚊和博乐县的全沟硬蜱中分离出WEEV[3]。西部马脑脊髓炎为我国出入境检验检疫中规定的一类检疫对象。 随着马匹国际贸易和国际赛事的日益频繁，来自不同的国家和地区、健康状况不同的马匹可能将该病带进我国，对此除实施严格的隔离检疫制度之外，开展西方马脑炎的快速检测技术也非常重要。

WEEV为单股正链RNA病毒，全长为11.5kb左右。基因组编码4种非结构蛋白（NSP1～4）和5种结构蛋白（衣壳蛋白C，包膜糖蛋白E1、E2、E3，6K，基因排列顺序为 5’-C-E3-E2-6K-E1-3’）。E2蛋白是该病的主要保护性抗原，具有7个部分重叠的抗原表位，分别与血凝抑制、中和病毒和抗病毒感染活性有关，而E2-1区中的C区是甲病毒属特异性抗原表位，含病毒与细胞作用的受体[4]。

目前西部马脑脊髓炎主要检测方法包括病毒分离和鉴定，血清学检测方法（血凝抑制和ELISA）以及基于RT-PCR的检测方法[1]。本研究采用MGB修饰短探针建立的针对WEEV的TaqMan荧光RT-PCR方法具有快速、灵敏，特异和操作简单等优点， 适用于本病流行地区的疫情监测，同时也可应用于马匹等动物的出入境检测。

1 材料和方法

1.1 试剂

1.1.1 病毒核酸

西部马脑脊髓炎病毒McMillan核酸、东部马脑脊髓炎病毒（ssp. North American variant）核酸，由军事医学科学院提供；马动脉炎病毒核酸、马疱疹病毒1型核酸、马流感病毒H3N8核酸，均由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

Trizol购自GIBCO/BRL公司；M-MLV反转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、RNA酶抑制剂等购自Promega公司；DNA快速纯化回收试剂盒、 质粒快速提取纯化试剂盒、pMD20-T载体购自Takara公司； Ribo MAXTMLarge Scale RNA Production System-SP6 购自 Promega 公司。

1.1.3 实时荧光定量PCR仪

LightCycler 2.0，Roche公司产品；ABI7900，ABI公司产品。

1.2 荧光定量RT-PCR反应引物和探针的设计与合成

对已经发表的WEEV分离株全序列用Vector NTI进行序列比对分析，选择序列中高度保守区域，设计合成引物和探针。引物和探针由上海基康生物技术公司合成，序列见表1。

表1 引物、探针的名称、序列及基因组位

1.3 实时荧光RT-PCR反应条件的优化

以西部马脑脊髓炎病毒McMillan核酸作为扩增模板，对各种反应条件进行优化。对引物浓度、探针浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶、逆转录酶用量、循环参数等条件进行了优化，来确定最佳反应条件。

1.4 体外转录合成病毒cRNA

设计合成特异性引物扩增包含WEEV主要结构蛋白片段（约2.5kb核苷酸片段，引物序列和位置见表2，包含有荧光定量RT-PCR扩增区域），将扩增片段纯化回收后分别克隆于pMD20-T载体中。将质粒线性化之后，用RiboM -AXTMLarge Scale RNA Production Systems- SP6试剂盒进行体外转录。转录产物经无RNase的DNase消化除去其中的DNA模板后，75℃ 10min将DNase灭活，再次抽提纯化制备出所需cRNA，按照20 μL/管分装，置-80℃保存备用。

表2 引物名称、序列及基因组位置

1.5 标准质控品制备与初步定值

取制备的cRNA作1：100稀释，测定其260nm和280nm的吸光度值（A260和A280）并计算拷贝数，用75% Trizol水溶液（Trizol：水＝3：1）稀释至1.0×108拷贝数/mL。然后进行分装，1.0 mL/管。

1.6 标准质控品均匀性检验

随机抽取10管制备的标准质控品，按照GB/T 19438.1-2004所述方法提取RNA。应用建立的WEEV荧光RT-PCR方法在一次试验中测试提取的10份RNA样品，每个样品重复2孔检测，手动设置基线，获取Ct值。结果数据用单因素方差分析统计处理。

1.7 标准质控品稳定性检验

随机抽取制备的标准质控品，在以下每种条件下放置10支[5]：（1）室温20℃～25℃，相对湿度20% ～ 50%，14d取出进行测试；（2）冰箱冷藏温度2℃～8℃，6个月取出进行测试；（3）-20℃，1年后取出进行测试；（4）对照，-80℃，长期放置。将纯化的含有WEEV 目的基因的质粒通过测定其260nm的吸光度值，计算出其拷贝数，系列稀释制成一系列外标品。应用建立的荧光RT-PCR方法来间接测定上述RNA的拷贝数。采用两样本均数显著性检验-t检验进行统计分析。

1.8 检测极限的确定（灵敏度试验）

把制备的cRNA标准质控品作系列稀释，用去离子水作阴性标准，按优化的条件进行荧光RTPCR测定，由此确定方法的检测极限。

1.9 特异性试验

用建立的方法对西部马脑脊髓炎病毒核酸、东部马脑脊髓炎病毒核酸、马动脉炎病毒核酸、马疱疹病毒1型核酸、马流感病毒H3N8核酸进行检测，以验证方法的特异性。

1.10 重复性试验

各选取3个不同浓度的cRNA标准模板，用所建立的荧光定量RT-PCR检测方法进行3次重复性试验，以验证方法的可重复性和稳定性。

1.11 对临床样品的检测

用上述两种方法对所采集的197份进口马血样品进行检测，验证方法的临床实用性。

2 结果

2.1 引物和探针的设计与合成

对设计的引物和探针进行BLAST分析，证实引物与探针高度特异，并可覆盖所有西部马脑脊髓炎病毒株。

2.2 实时荧光RT-PCR反应条件的优化

以西部马脑脊髓炎病毒McMillan株核酸作为扩增模板，经多次重复性试验发现，西部马脑炎病毒检测方法最适反应总体积25 μL，其中模板10 μL，最适引物浓度为0.4 μmol/L，探针浓度为0.2 μmol/L，Mg2+浓度为4 mmol/L；最适循环参数为42℃/30 min，94℃/3 min；之后94℃/10s，56℃ /5s，60℃ /30s，40 个循环。

2.3 体外转录合成cRNA标准模板

经RT-PCR扩增，获得西部马脑脊髓炎病毒McMillan株7442nt ～10011nt片段（约2.5kb核苷酸片段，包含有荧光定量RT-PCR扩增区域），扩增产物见图1。将扩增片段纯化回收后克隆于pMD20-T载体中，质粒命名为pMD20-T-Weev（7442nt ～10011nt）。经体外转录获得cRNA纯品。

图1 目的片段RT-PCR扩增结果

2.4 标准质控品的制备

获得的cRNA纯品的A260和A280比值为2.043，表明RNA纯度较高。将置于75% Trizol水溶液中含量为108拷贝数/mL的标准质控品按照1.0 mL/管进行分装，置-80℃保存。

2.5 均匀性检验结果

均匀性检验结果数据用SPSS软件进行单因素方差分析统计处理。F值＜F0.05临界值，结果见表3，表明标准质控品中的核酸片段是均匀分布的。且分装的标准质控品瓶间变异系数小于5%。

表3 西部马脑脊髓炎标准质控品均匀性检验结果

2.6 稳定性检验结果

不同条件下放置制备的标准质控品的检测结果见表4。将检测组与对照组（ - 80℃）数据分别作两样本均数显著性检验-t检验进行统计分析，结果表明检测组与对照组差异均无统计学意义（ P>0.05）。

表4 西部马脑脊髓炎标准质控品t检验统计结果

2.7 检测极限的测定（灵敏度试验）结果

结果显示，本方法的检测灵敏度可达10拷贝/反应（图2）。

图2 WEEV荧光RT-PCR 检测方法的检测极限测定

2.8 特异性检测结果

对1.1.1中的病毒核酸进行检测，结果显示，建立的方法只能检出西部马脑脊髓炎病毒，但不能检出其他病原（图3），表明所建立的检测方法特异性好。

图3 WEEV荧光RT-PCR 检测方法的特异性试验结果

2.9 重复性检测结果

对105～107拷贝数cRNA 模板进行连续3 次检测，变异系数均<5%（表5）。

表5 重复性试验结果

2.10 临床样品检测结果

应用建立的方法对197份进口马血样品进行检测，结果显示进口马血均为WEEV阴性，并与文献报道的RT-PCR进行比较[6]，两者符合率为100%（表6）。

表6 临床样品检测结果

3 讨论

西部马脑脊髓炎是重要的虫媒传染病，可引起人和马的脑脊髓炎，导致神经组织受损严重。据报道，本病在美国西部、加拿大、墨西哥以及中美洲和南美洲均有发生。也有报道说我国曾从新疆分离到WEEV[1，3]。本病主要呈蚊－鸟传播方式。蚊是病毒的传播媒介，鸟是病毒的贮存宿主，病毒可在蚊体内增值并可达较高滴度，并持续终生存在。尽管本病的确诊必须依靠病毒分离、鉴定，病毒抗原检测等传统方法，但现在国外越来越多实验室采用核酸快速检测方法来快速诊断本病[6]。

由于普通RT-PCR存在灵敏度较低、特异性稍差等缺点，难以满足潜伏期感染和传播媒介体内病毒的检测需求。TaqMan探针实时荧光RT-PCR方法灵敏特异，特别是结合MGB探针检测技术，灵敏度更为提高。本研究通过比对WEEV 不同代表株序列，设计合成引物和MGB修饰探针，对其以及反应条件进行优化。并用含有扩增区域的大片段核酸经体外转录制备标准质控品cRNA，建立了WEEV通用型荧光定量RT-PCR检测技术，实现了对WEEV的快速检测。此外，通过体外转录制备标准品cRNA，测定了方法的分析灵敏度，使该方法更加完善成熟。特异性、重复性试验证明了该方法特异、可重复性好，利用建立的荧光定量RTPCR方法检测临床样品197份，结果均为阴性，与文献报道的普通RT-PCR方法检测结果一致，表明本方法检测结果可信程度高，为WEEV检验检疫以及防治奠定了重要基础。

[1]Office International des Epizooties. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals[M]. Paris： Office International des Epizooties， 2008： 858-865.

[2]Monath T P. Arthropod-borne encephalitis in the Americas[J]. Bull WHO， 1979， 57：513–533.

[3]何海怀，吕新军，杨益良. 我国分离的两株病毒为重组甲病毒[J].中华实验和临床病毒学杂志， 2001， 15（2）：120-124.

[4]Strauss J H， Strauss E G. The Alphaviruses： gene expression， replication and evolution [J]. Microbiol Rev，1994， 58 （3）： 491.

[5]GB/T15000.3-2008. 标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法[M]. 北京：中国标准出版社，2008：1-47.

[6]Lambert A J， Martin D A， Lanciotti R S. Detection of North American Eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid ampli fi cation assays [J]. J Clin Microbiol， 2003，41（ 1 ）：379–385.