微水相酸性蛋白酶催化蔗糖乙酸酯合成研究

钱俊青，宋大威，单昱东

（浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310032）

微水相酸性蛋白酶催化蔗糖乙酸酯合成研究

钱俊青，宋大威，单昱东

（浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310032）

探索微水环境中酸性蛋白酶催化蔗糖和乙酸乙烯酯的酯化反应，对催化合成蔗糖乙酸酯的反应溶剂进行比较，确定四氢呋喃为较好的反应介质，并详细考察了该反应的参数：缓冲液pH值、含水体积分数、反应温度以及反应时间对酯化效果的影响.确定了该酯化反应的最优工艺条件：缓冲液pH为5.4，反应温度为40℃，反应14 h后，每0.68 g蔗糖可制得蔗糖乙酸酯30.46 mg，蔗糖-6-乙酸酯占总酯质量的61.58%.

酯化；酸性蛋白酶；蔗糖乙酸酯

蔗糖酯由于具有良好的乳化性、无刺激性和易降解性等优点在医药、化工及食品等领域具有广泛的用途［1－2］.目前有文献报道，从自然界分离出的葡萄糖单元上多取代的蔗糖酯已被证实具有抗虫和抗菌活性［3－5］，从茄科植物分离出来的蔗糖酯是烟草香味的重要来源［6］.而蔗糖酯中的蔗糖-6-乙酸酯则是合成甜味剂三氯蔗糖的重要中间体.

三氯蔗糖作为一种新型的非营养型甜味剂，在人体内几乎不被吸收，热量值为零，是肥胖症、心血管病和糖尿病患者理想的辅助治疗产品，因此在医药中应用价值很大，市场前景较为广阔［7－8］.目前，世界上只有英国Tate-Lyle公司和美国Johnson公司联合实现了三氯蔗糖的自主工业化生产.因此，对于合成三氯蔗糖的重要中间体蔗糖-6-乙酸酯的合成进行研究具有广阔的应用前景［9］.又因酶法合成蔗糖酯由于其高效的结构选择性和条件温和等优点被广泛的研究和应用［10］.因此，笔者采用酸性蛋白酶为催化剂，去探索一种合成蔗糖-6-乙酸酯的新方法.

1 实验部分

1.1 实验试剂与仪器

蔗糖及所有有机溶剂均为市售分析纯；酸性蛋白酶，酶活5 000 U／g，湖州礼来生物技术有限公司；Agilent 1200高效液相色谱仪，Alltech 3300蒸发光检测仪（ELSD）.

1.2 蔗糖乙酸酯合成方法

在50 mL的具塞磨口三角瓶中加入一定量蔗糖和酸性蛋白酶，用移液管按顺序定量移入缓冲液、有机溶剂及乙酸乙烯酯，并置于摇床内震荡反应，反应结束后反应液用偏氟乙烯微孔滤膜滤去悬浮酶颗粒等杂质，HPLC-ELSD进行定量分析，每组实验做三个平行.

1.3 产物定量分析方法

色谱条件：流动相：0.1%醋酸水溶液，流速0.8 mL／min，柱温30℃，进样量2μL.蒸发光检测器温度85℃，氮气流速1.5 L／min.产物结构通过标样出峰时间和液质联用分子量大小确定.产物定量分析可以通过色谱峰面积归一法，计算出产物生成量［10］.

2 结果与讨论

2.1 纯有机相反应

在50 mL的具塞磨口三角瓶中加入蔗糖0.68 g、丙酮、异丙醇、四氢呋喃、叔丁醇和叔戊醇等五种有机溶剂各10 mL，以及乙酸乙烯酯1.80 mL和酸性蛋白酶0.04 g置于40℃摇床内反应12 h后，对产物进行分析，发现酸性蛋白酶在纯有机溶剂中不表现出活性，没有得到酯化产物.

2.2 加入少量缓冲液对酯化反应的影响

在2.1反应条件基础上，加入0.40 mL（占体系总体积的4%）0.20 mol／L的醋酸钠－醋酸缓冲液，并加入一组有四氢呋喃但不加酶其他条件相同的平行样做比较进行反应，经分析后所得酯化产物情况如图1所示，只有四氢呋喃作为有机溶剂体系时，才产生了6位蔗糖乙酸酯，酸性脂肪酶表现出了6位蔗糖乙酸酯结构选择专一性.这一现象可能是由于溶剂的结构和疏水性等理化性质的不同，使酶和底物的结合形成中间态的取向不同，导致不同酰化位点的暴露而产生了选择差异性.

2.3 体系中缓冲液体积分数对酯化效果影响

图1 加入缓冲液后各有机溶剂中总酯及6位酯产量Fig.1 Effect of organic solvent with buffer on the enzymatic synthesis of sucrose esters

实验中加入占反应体系一定百分体积含量的去离子水或者pH为5.4，浓度为0.20 mol／L的醋酸钠－醋酸缓冲液来考察体系中缓冲液体积分数对产物的影响，总酯产量以及蔗糖-6-乙酸酯选择性见图2，在总酯产量上，酸性蛋白酶的缓冲液体系始终高于去离子水体系，这是因为去离子水无法提供酸性环境.综合总酯转化率及蔗糖-6-乙酸酯选择性考虑，当加入原体系体积3%的醋酸钠－醋酸缓冲液时，其产物量最多，酯化效果最好.

图2 体系中水和缓冲液体积分数酯化反应的影响Fig.2 Effect of buffer volume ratio on the enzymatic synthesis of sucrose esters

2.4 缓冲液pH值对酯化反应的影响

在2.3反应条件基础上，选取不同pH的0.20 mol／L的醋酸钠－醋酸缓冲液0.3 mL（占体系总体积的3%）加入到四氢呋喃反应体系中，反应结束后，总酯产量以及蔗糖-6-乙酸酯选择性见图3.结果显示总酯产量随着pH值的增大而增大，当缓冲液pH值为5.4时总酯产量达到最高，当pH值大于5.4后，总酯产量有较显著的下降；蔗糖-6-乙酸酯选择性则随着pH值的增加而上下波动，但变化不大.综合各个因素考虑，选择最适pH为5.4.

2.5 反应温度对酯化效果影响

温度是影响酶促反应的重要因素，过高过低的温度会改变酶分子构象，影响到酶的催化活性.实验结果如图4所示，当温度低于40℃时，反应速率随着温度的升高而增加，当超过40℃时，酯化反应效果及选择性出现明显下降，当温度达到50℃时，酸性蛋白酶已无法选择性合成蔗糖-6-乙酸酯.因此，选择酯化反应最佳温度为40℃.

图3 醋酸钠－醋酸缓冲液中pH对酯化反应的影响Fig.3 Effect of initial pH of buffer on the enzymatic synthesis of sucrose esters

图4 反应温度对酯化反应的影响Fig.4 Effect of temperature on the enzymatic synthesis of sucrose esters

2.6 酯化反应进程

图5 时间对酯化反应的影响Fig.5 Effect of time on the enzymatic synthesis of sucrose esters

酶催化酯化反应是一类可逆反应，在一定时间内随着反应的进行酯化率逐渐增加，当体系达到动态平衡后，酯化率也达到平衡值.实验结果如图5所示，当反应时间在14 h，总酯转化率达到最高，而6位酯的产量随着时间上下波动，变化不大，得出最佳酯化反应时间为14 h.可制得蔗糖乙酸酯30.46 mg，蔗糖-6-乙酸酯占总酯质量的61.58%.

3 结 论

提出了全新的微水相环境下四氢呋喃／缓冲液反应体系，应用于酸性蛋白酶催化蔗糖和乙酸乙烯酯的酯化反应.探索出不同有机溶剂及各工艺参数对反应的影响，使得酸性蛋白酶的酯化能力和选择性有了更好的提高.为后续的蔗糖-6-乙酸酯合成研究提供了科学依据.同时，随着蔗糖酯产品的需求量逐年增加，蛋白酶催化合成蔗糖酯将更会具有越来越大的科学研究和实际应用价值.

［1］林秀杰，薛桂芬.蔗糖酯的合成与应用研究进展［J］.化工纵横，2001（2）：10-12.

［2］李祖义，徐国梁，袁长贵，等.生物表面活性剂催化合成蔗糖酯及其应用［J］.上海化工，1999，24（21）：6-9.

［3］FERRER M，SOLIVERI J，PLOU FJ，et al.Synthesis of sugar esters in solvent mixtures by lipases from Thermomyces lanuginosus and Candida antarctica B，and their antimicrobial properties［J］.Enzym and Micro Tech，2005，36：391-398.

［4］CHORTYK O T，KAYS S J，TENG Q.Characterization of insecticidal sugar esters of petunia［J］.J Agric Food Chem，1997，45（1）：270-275.

［5］OVENDEN S P B，YU Jin，BERNAYS J，et al.Physaloside a，an acylated sucrose ester from pHysalis viscose［J］.J Nat Prod，2005，68：282-284.

［6］SEVERSON R F，ARRENDALE R F，CHORTYK O T，et al.Isolation and characterization of the sucrose esters of the cuticular waxes of green tobacco leaf［J］.J Agric Food Chem，1985，33：870-875.

［7］PALOCCI C，FALCONI M，ALCARO S，et al.An approach to address Candida rugosa lipase regioselectivity in the acylation reactions of trytilated glucosides［J］.J of Biotech，2007，128：908-918.

［8］陆正清，沈彬，张满.原酸酯法制备蔗糖-6-乙酸酯的研究［J］.食品研究与开发，2006，27（1）：20-22.

［9］黄素梅，张海广，黎四芳.强力甜味剂三氯蔗糖的应用和生成工艺探讨［J］.化工时刊，2000（2）：21-23.

［10］罗旭，钱俊青.叔丁醇体系中脂肪酶催化合成蔗糖乙酸酯［J］.高校化学工程学报2010，24（3）：451-454.

The research of the synthesis of sucrose acetata catalyzed with acid protease in micro-aqueous

QIAN Jun-qing，SONG Da-wei，SHAN Yu-dong
（College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

In order to explore the esterification between vinylacetate and sucrose catalysed by acid protease in trace water system，in this resarch，various reaction solvents were screened，and finally the Tetrahdrofuran was selected as the best solvent.The effects of the reaction parameters were investigated and the optimum operation conditions are obtained as follows：buffer pH＝5.4，V（water）∶V（Tetrahdrofuran）＝3%，reaction temperature of 40 ℃.Under the optimum conditions mentioned above，every 0.68 g sucrose can introduce 30.46 mg sucrose acetate after 14 h，the selectivity of 6-sucrose acetate reached 61.58%.

esterification；acid protease；sucrose acetate

Q814.9

A

1006-4303（2013）02-0119-03

2012-02-16

国家863科技项目（2006AA10Z311）

钱俊青（1964—），男，浙江绍兴人，教授，博士，研究方向为天然药物，E-mail：qjq＠zjut.edu.cn.

（

陈石平）