高迁移率族蛋白B1对激素难治性前列腺癌冷冻免疫反应的影响

刘长富，郭 志，司同国，邢文阁，刘 方，于海鹏

高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一种存在于真核生物细胞内的非组蛋白染色体结合蛋白，参与包括基因转录、DNA修复等多种生物学过程［1-2］，释放至细胞外的HMGB1可作为内源性免疫调节因子，影响免疫反应的启动和激烈程度［3-4］。相关研究显示，HMGB1在多种肿瘤细胞中呈高表达［1，5-7］，冷冻消融治疗是否能在导致大量肿瘤细胞坏死的同时使肿瘤细胞内的HMGB1释放至细胞外，这些释放的HMGB1是否能促进树突状细胞（DC）数量增加及增高其活化程度，进而对冷冻免疫反应产生影响，目前尚少见相关研究报道。

1 材料与方法

1.1 细胞系及实验动物皮下移植瘤模型建立

小鼠前列腺癌细胞 （RM-1）株由上海中科院细胞库提供。清洁级纯种近交系C57BL/6（H-2Db/b）雄性小鼠50只，6～8周龄，体重18～22 g，购自中国科学院天津血液病研究所实验动物中心。取对数生长期的RM-1细胞，调细胞浓度至5×106个/ml。取雄性C57BL/6小鼠，用1 ml注射器将0.1 ml肿瘤细胞接种于右腹股沟皮下，每3 d观察肿瘤生长情况。

1.2 实验分组

将50只RM-1细胞激素非依赖性前列腺癌模型小鼠随机分为对照组25只，不予任何治疗；治疗组25只，给予冷冻消融治疗。

1.3 氩氦冷冻消融治疗技术操作步骤

接种肿瘤后第2周（肿瘤直径约1 cm），于荷瘤鼠腹腔内注射10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉后，仰卧固定于操作台上。采用的氩氦冷冻消融系统（CryocareTMSurgical System）为美国Endocare公司产品。右侧腹股沟处常规消毒、铺巾，在瘤旁切一小口，直视下将直径1.7 mm的氩氦冷冻探针刺入肿瘤组织内6～8 mm。启动氩气，工作压力17 225 kPa（2 500 psi），初始功率均为20%条件下，冷冻时间为30 s，冰球完全覆盖肿瘤，可见肿物表面完全覆盖冻霜，中央温度可达－120℃，启动氦气复温至10℃，为第1个冷冻循环。同样方法重复第2个冷冻循环。冷冻治疗结束后拔出冷冻器，缝合皮肤。

1.4 标本采集

两组分别于治疗前、治疗后1、7、14、21 d各取5只小鼠，无菌条件下，取肿瘤组织并制备单细胞悬液。

1.5 Western印迹及流式细胞仪检测

采用Western印迹法检测不同时间点肿瘤局部组织中HMGB1表达情况，Western印迹反应结果应用Bio-Rad凝胶成像系统（Bio-Rad公司，美国）照相记录，应用QuantityOne Basic软件进行条带灰度扫描，计算积分吸光度（IA）值。收集的细胞悬液混匀后，分别取100 μl加入离心管，分别标定为CD11c、CD86、CD80，同时设标准对照管，应用流式细胞仪（BD公司，美国）检测细胞表面抗体的表达情况。

1.6 统计方法

采用SPSS13.0软件包进行数据分析。将数据统一编码后，录入EXCEL数据库，数据以均数 ±标准差 （±s）表示。组内不同时间点的比较采用ANOVA方差分析、各时间点两组之间比较采用Kruskal-Wallis H检验、相关性分析采用Pearson检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前、后肿瘤局部组织中HMGB1表达

与术前比较，治疗组术后第7天肿瘤局部组织中HMGB1表达水平显著增高（P＜0.01），随时间延长逐渐下降，至术后21 d恢复至术前水平 （P＞0.05）。对照组肿瘤局部HMGB1表达水平无明显改变，各时间点之间比较，差异无统计学意义 （P＞0.05）。相同时间点肿瘤局部HMGB1表达水平在术后1、7、14 d治疗组均高于对照组，组间差异有统计学意义（P ＜ 0.01）。 见表1 和图1。

2.2 治疗前、后肿瘤局部浸润DC细胞比例变化

表1 术后肿瘤局部HMGB1蛋白表达水平变化 （n=5，±s）

表1 术后肿瘤局部HMGB1蛋白表达水平变化 （n=5，±s）

注：a与术前比较 P ＜ 0.05；b与对照组比较 P ＜ 0.05

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图1 治疗组术后肿瘤局部HMGB1表达水平

与术前比较，治疗组术后第7天肿瘤局部组织中DC细胞比例显著增高（P＜0.01），随时间延长逐渐下降，至术后 21 d恢复至术前水平（P ＞0.05）。对照组肿瘤局部DC细胞比例无明显改变，各时间点之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗组术后1、7、14 d相同时间点肿瘤局部DC细胞比例均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。 见表2。

表2 肿瘤局部DC细胞比例变化 （n=5，±s）

表2 肿瘤局部DC细胞比例变化 （n=5，±s）

注：a与术前比较 P ＜ 0.05；b与对照组比较 P ＜ 0.05

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2.3 冷冻消融治疗对肿瘤局部DC活化比例的影响

与术前比较，治疗组术后第1天肿瘤局部DC活化比例开始增多（P＜0.01），于术后第7天达最高值（P ＜ 0.01），之后随时间延长，逐渐下降，至术后第21天恢复至术前水平（P＞0.05）。对照组肿瘤局部DC活化比例无明显改变，各时间点之间比较差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。 术后 1、7、14 d 相同时间点肿瘤局部DC活化比例治疗组均高于对照组，组间差异有统计学意义（P＜0.01）。 见表3。

表3 治疗后肿瘤局部DC活化比例变化 （n=5，±s）

表3 治疗后肿瘤局部DC活化比例变化 （n=5，±s）

注：a与术前比较 P ＜ 0.05；b与对照组比较 P ＜ 0.05

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治疗组肿瘤局部HMGB1表达量与DC数量、活化比例均成高度正相关（r=0.883，r=0.997，P ＜0.05）。

3 讨论

HMGB1广泛分布于高等生物真核细胞核内，多种病理过程中组织细胞的坏死和损伤，均可使核内的HMGB1游离并释放至细胞外甚至血清中，作为细胞因子的HMGB1释放到细胞外可产生多种生物学效应［3-4］。相关研究显示HMGB1在多种肿瘤均呈高表达［1，5-7］，氩氦冷冻消融治疗作为一种物理消融治疗方式能短时间内导致肿瘤细胞坏死，在肿瘤细胞坏死的同时是否会导致肿瘤细胞内HMGB1释放至细胞外，以及HMGB1释放至细胞外的量与时间的关系如何，国内外尚少见相关文献报道。

本实验结果显示，对荷瘤小鼠实施冷冻消融治疗后肿瘤局部组织中HMGB1明显增高，并于术后第7天达最高值，之后随着时间延长逐渐下降于术后第21天恢复至术前水平。以往实验结果证实，HMGB1 在前列腺癌组织中高表达［1，7］。冷冻消融治疗可以导致肿瘤细胞大量坏死，而细胞坏死或损伤是HMGB1释放的重要途径之一［8］，因此我们有理由相信肿瘤组织局部存在的大量HMGB1是由冷冻消融导致肿瘤细胞坏死后释放至细胞外。同时本实验结果亦显示在接受冷冻消融治疗后，HMGB1于术后第7天达到最高值，分析其原因主要为：氩氦冷冻消融治疗可使肿瘤组织快速冷至－160℃以下，可直接引起癌细胞脱水和破裂；同时也会破坏肿瘤小血管而致缺氧，进而导致更多的肿瘤细胞死亡［9］，释放更多的HMGB1。

新近研究表明，作为免疫佐剂的HMGB1能够加速炎性粒细胞向抗原侵入的地方移动，并能促进APC和DC活化，并且能加速他们到达淋巴结及促进静止的T淋巴细胞活化，诱导细胞毒性因子释放，间接影响其他免疫细胞［10-13］。有关坏死细胞反应的成熟DC细胞中是否含有HMGB1的研究结果显示，在坏死的海拉癌细胞株培养上清液中含有具有HMGB1的成熟的DC细胞，在上清液中加入HMGB1抗体能阻止DC成熟，缺乏HMGB1的上清液中坏死细胞诱导DC细胞成熟作用明显减弱［14］。冷冻消融导致肿瘤细胞坏死释放的HMGB1对DC数量的变化及活化程度能够产生何种影响，本研究将肿瘤局部组织中DC数量、DC活化比例与肿瘤组织局部HMGB1的表达水平行相关分析，结果显示DC细胞数量及活化程度与肿瘤组织HMGB1表达水平呈高度正相关关系。说明冷冻消融治疗后机体内HMGB1介导了体内DC数量、DC活化比例的增高。上述结果说明单纯冷冻消融治疗能够通过HMGB1释放刺激机体DC数量增加和活化程度提高，进而增强机体特异性抗肿瘤免疫反应。

然而，HMGB1通过何种确切的机制实现对DC以及冷冻免疫反应的调节有待深入研究。随着对冷冻免疫反应及其受体调控机制研究的深入及相关信号通路的逐渐阐明，将为冷冻免疫反应研究开辟新途径。

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