鱼油对阿霉素诱导慢性心力衰竭大鼠心肌结构和细胞因子的影响

滕丽莉 赵荫涛 邵 莉 江 华 张代富 张 华

(同济大学附属东方医院老年医学科，上海 200120)

慢性心力衰竭(CHF)是各种原发性或继发性心血管疾病发展到一定阶段的共同表现，不仅严重危害人类的健康，而且对患者、家庭和社会带来了沉重的医疗负担。目前，世界各国CHF的发生率均呈上升趋势，死亡率居高不下。由于心衰的高发病率及高病死率，CHF的发病机制及治疗历来都是人们研究的重点。本实验主要采用阿霉素诱导建立大鼠心衰模型，使用鱼油对心衰大鼠进行干预，旨在探讨鱼油对阿霉素诱导的心力衰竭大鼠的心肌结构和细胞因子的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠46只(购于复旦大学实验动物科学部)，称重(250±20)g。随机分成2组:对照组(n=10)和阿霉素组(n=36)。

1.2 试剂与仪器 小动物高分辨率体内超声检测仪;高频超声探头(加拿大Visual Sonics公司);阿霉素(注射用盐酸多柔吡星，浙江海正药业股份有限公司);盐酸氯胺酮注射液(江苏恒瑞医药有限公司);CM1900冰冻切片机(Leica公司);酶标仪(MK3，芬兰Thermo);大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-αELISA试剂盒，大鼠白介素(IL)-10 ELISA试剂盒(均为上海西唐生物科技有限公司进口分装)。

1.3 大鼠CHF模型的建立 大鼠腹腔注射阿霉素溶液1 ml/kg(按2 mg/kg阿霉素，用生理盐水配成2 mg/ml，即1 ml/kg阿霉素，根据体重变化调整药物剂量，每周1次，造模时间共持续8 w，累计用量约16 mg/kg)。对照组大鼠腹腔注射等体积的无菌生理盐水(注射时间同阿霉素组，共8 w)。实验过程中定期观察大鼠的精神状态、活动量、进食量、体重等大体情况。

1.4 超声心动图对动物模型进行评价 大鼠腹腔注射氯胺酮(2 ml:0.1 g，对照组按100 mg/kg，ADR组按70 mg/kg)全身麻醉，8%Na2S脱去大鼠前胸部皮毛。采用小动物高分辨率体内超声检测仪vevo770模式，在给药后行经胸高频超声心动检查。在二维切面上显示胸骨旁左心长轴，M型超声心动图法测量，测量指标有左室舒张末期内径(LVDD)、左室收缩末期内径(LVSD)等，并自动计算出左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)。所有指标均在3个连续的心动周期中完成，获取数据存储于光盘中。所有测量工作均由有经验的医师在同一超声仪上完成。

1.5 鱼油干预结束后采用超声心动图进行评价 造模后的26只阿霉素组大鼠随机分为2组:心衰组和鱼油组，每组13只，以及对照组大鼠10只，每周测体重一次，根据体重调整药物剂量。鱼油组(n=13):剂量按体重的0.6%灌胃，每天1次，共8 w;心衰组(n=13):等量生理盐水灌胃，共8 w;对照组(n=10):等量生理盐水灌胃，共8 w。实验过程中定期观察大鼠的精神状态、活动、毛色、进食、腹水、体重等大体情况。干预结束后再次用同样的方法对心衰组及鱼油组大鼠进行超声心动图检查。

1.6 心肌HE染色 断头处死所有大鼠，取心肌组织先经液氮速冻，放置－80℃冷冻后制备冰冻切片，常规HE染色，光学显微镜观察其组织学特点。

1.7 细胞因子的检测 断头处死大鼠时留取抗凝血4 ml，于4℃下1 500 r/min离心10 min，取上清，分装冻存于－80℃ 冰箱，集中采用ELISA法检测TNF-α和IL-10水平。

1.8 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，数据用x±s表示。

2 结果

2.1 造模结束后超声心动图指标 动物均分笼饲养在18℃ ～20℃SPF环境中，自由取食和饮水，第8周末共有26只阿霉素组大鼠存活。造模结束后给两组大鼠做心脏超声，结果发现阿霉素组存活的大鼠心腔普遍扩大，室壁活动度减弱，均出现心功能指标异常，LVDD、LVSD明显升高，与对照组相比有统计学差异(P＜0.05)，LVEF和LVFS明显低于对照组(P＜0.05)，表明有左心室收缩功能障碍。对照组大鼠超声心动图检查均未发现心功能异常。见表1。

表1 正常对照组和阿霉素组大鼠第8周末超声心动图心功能指标(x±s)

2.2 鱼油干预结束后超声心动图进行评价 与对照组相比，心衰组LVDD、LVSD均显著增加(P＜0.05)，LVEF、LVFS均降低(P＜0.05)。而鱼油组LVDD、LVSD均较心衰组显著降低(P＜0.05)，LVEF、LVFS均较心衰组显著增加(P＜0.05)。见表 2，图 1。

图1 3组大鼠心脏超声比较

表2 各组大鼠心脏超声指标比较(x±s)

2.3 心肌形态结构改变 图2可见，心肌组织HE染色显示:对照组心肌细胞排列整齐，细胞间隙正常，胞核清晰，高倍镜下可见清晰横纹，未见胞体水肿，组织间隙无炎性渗出;心衰组大鼠心肌细胞失去正常结构形态、排列明显不规则、部分呈水肿和空泡变性，部分出现灶性坏死，部分心肌纤维出现溶解断裂，心肌细胞间隙明显增宽，可见中性粒细胞及单核细胞、淋巴细胞的浸润;PUFA组可见心肌细胞变性和坏死，心肌细胞间隙增宽，但程度和范围均较心衰组减轻。

图2 光镜下大鼠心肌组织HE染色图片(×400)

2.4 细胞因子的变化 与对照组相比，心衰组TNF-α和IL-10浓度升高，且上调IL-10/TNF-α比值(P＜0.05);与心衰组相比，鱼油组TNF-α和IL-10浓度降低，且下调IL-10/TNF-α比值(P＜0.05)。见表3。

表3 各组大鼠TNF-α、IL-10和IL-10/TNF-α 的变化(x ± s，pg/ml)

3 讨论

CHF是指于心排出量绝对或相对减少，不能满足机体组织需要的一种病理生理状态。目前用于CHF动物模型的制作方法较多，主要有以下几大类:①压力超负荷所致，包括有主动脉缩窄，主动脉狭窄，肺动脉缩窄，肺动脉狭窄和实验性高血压动物〔1〕;②容量超负荷过度所致，包括快速大量输液，二尖瓣关闭不全，主动脉瓣关闭不全，动静脉瘘，下腔静脉狭窄〔1〕;③心脏快速起搏所致〔1〕;④结扎冠状动脉或冠脉内注入微栓子〔1〕;⑤遗传性心衰模型〔2〕;⑥心肌毒性及抑制药物:如阿霉素多用于建立慢性心衰模型，普萘洛尔、戊巴比妥钠、维拉帕米多用于建立急性心衰模型〔1〕。

阿霉素是一种广谱高效的蒽醌类肿瘤化疗药物，对白血病、淋巴瘤等多种肿瘤的化疗效果良好。由于它的心肌组织高亲和性而具有严重的心脏毒性，长期大剂量使用会引起中毒性心肌炎、心肌病和心律失常，甚至出现严重的心力衰竭。本实验发现阿霉素组大鼠在给药第2周后普遍出现了食欲下降、活动量减少、发绀、腹泻、口鼻周围有粉红色分泌物等CHF的常见表现，并且心脏超声检查结果显示给药组大鼠心脏扩大，心腔扩大，室壁活动度明显减弱，LVEF值逐渐降低，大鼠LVDD进行性增加，心室收缩和舒张功能均减退，均与人类临床扩张型心肌病特征相符，因此该实验提供了建立阿霉素大鼠的心肌病及CHF模型的方案。

鱼油中富含一系多不饱和脂肪酸，尤其是其中的廿碳五烯酸，和廿二碳六烯酸，具有降低血脂、抗血栓形成、延缓动脉粥样硬化和冠状动脉成形术后再狭窄闭、抗心律失常、影响血压及改善血液流变学等多种心血管效应〔3〕。目前各国研究者在鱼油的作用机制及其对机体的损害、应用等方面的研究已取得很大进展，鱼油制剂在人类心血管疾病防治工作中的地位日益受到重视。一项大规模的临床研究〔4〕结果显示，在指南心力衰竭标准治疗的基础上，相对于一种常用降胆固醇药，鱼油补充剂对治疗CHF可能更有效。本结果说明细胞因子之间的网络调控参与了心力衰竭的发生、发展;利用HE组织切片染色证实了鱼油对阿霉素诱导的心衰大鼠的保护作用。TNF-α具有许多不良作用〔5〕，包括心室重构、心肌抑制、心肌细胞凋亡等，TNF-α在体内外均有负性肌力作用。近年来IL-10在多种心血管病的发生发展中的作用均有报道，有研究表明〔6〕IL-10作为一种抗炎性细胞因子，能中和充血性心力衰竭过程中产生的炎性细胞因子，可直接对抗心肌由炎性细胞因子介导的损害，对心脏有保护作用。Yamaoka等〔7〕观察68例各种原因的CHF患者和31例正常对照患者的循环IL-10和IL-10受体水平，发现CHF组IL-10和TNF-α水平均高于对照组。应用鱼油干预阿霉素致心衰大鼠8 w后，心衰组大鼠血清的炎性细胞因子TNF-α、IL-10表达水平显著下降。IL-10/TNF-α比值也较心衰组降低，该比值反映促炎抗炎平衡状态，越接近平衡状态越有利于炎症性疾病的恢复。因此，我们推测n-3PUFAs可能通过调节细胞因子TNF-α和IL-10等的表达来改善心功能。这与文献报道的多不饱和脂肪酸摄入量和炎症细胞因子的相关性是一致的。鱼油的抗炎作用已经有很多相关报道〔6，8〕，许多研究结果表明，饮食摄入足量的鱼油对减少心衰患者的炎症因子水平是有益的。

1 Gupta S，Sen S.Animal models for heart failure〔J〕.Methods Mol Med，2006;129(1):97-114.

2 Ross J Jr.Dilated cardiomyopathy:concepts derived from gene deficient and transgenic animal models〔J〕.Circ，2002;66(3):219-24.

3 Parks JS，Rudel LL.Effect of fish oil on atherosclerosis and lipoprotein metabolism〔J〕.Atherosclerosis，1990;84(2-3):83-94.

4 Katan M，Morgenthaler N，Widmer I，et al.Copeptin，a stable peptide derived from the vasopressin precursor，correlates with the individual stress level〔J〕.Neuro Endocrinol Lett，2008;29(3):341-6.

5 Valgimigli M，Ceconi C，Malagutti P，et al.Tumor necrosis factor-alpha receptor 1 is a major predictor of mortality and new-onset heart failure in patients with acute myocardial infarction:the Cytokine-Activation and Long-Term Prognosis in Myocardial Infarction(C-ALPHA)study〔J〕.Circulation，2005;111(7):863-70.

6 Aukrust P，Ueland T，Lien E，et al.Cytokine network in congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy〔J〕.Am JCardiol，1999;83(3):376-82.

7 Yamaoka M，Yamaguchi S，Okuyama M，et al.Anti-inflammatory cytokine profile in human heart failure:behavior of interleukin-10 in association with tumor necrosis factor-alpha〔J〕.Jpn Circ J，1999;63(12):951-6.

8 Hoorn EJ，Geary D，Robb M，et al.Acute hyponatremia related to intravenous fluid administration in hospitalized children:an observational study〔J〕.Pediatrics，2004;113(5):1279-84.