竹茶酒对D-半乳糖衰老模型小鼠抗衰老作用的研究

李昱鼎 叶小辉 叶乃兴,* 林志达 郑德勇 陈兴煌

(1.福建农林大学 茶叶科技与经济研究所，福建 福州 350002；2.福建农林大学 食品科学学院，福建 福州 350002；3.福建农林大学 园艺学院，福建 福州 350002）

茶类酒是以茶叶为主要原料加工而成的新一代风味型酒，该酒酒度低，色泽鲜明透亮，入口软棉，不刺喉，不上头，同时富含功能成分[1]。竹酒是以竹叶或竹节为原料制成的一种竹香浓郁、纯正，清香甘甜，具有药用保健作用的特色酒[2]。兼具二者优点的竹茶酒具有独特而怡人的风味，而且含有较丰富的茶多酚、黄酮类化合物、氨基酸、茶多糖、蛋白质等功能成分，具有良好的抗氧化抗衰老，降低胆固醇，降低心脑血管疾病的发病率，增强免疫功能等作用。本实验观测了竹茶酒对D-半乳糖所致亚急性衰老模型小鼠肝脏及血清中SOD、GSH-Px活性以及MDA含量等指标的影响，对竹茶酒的抗氧化抗衰老功能特性进行验证。

1 材料与方法

1.1 供试材料

ICR小鼠，由吴氏实验动物中心提供；麻竹，由福建农林大学提供；白茶、绿茶由福建谦谦一叶茶业科技有限公司提供；D-半乳糖、抗坏血酸、考马斯亮蓝G250、冰醋酸、无水乙醇，均由国药集团化学试剂有限公司提供；丙二醛（MDA）测定试剂盒、总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）测试盒，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 主要仪器和设备

1.3 试验方法

1.3.1 竹茶酒的制备

茶叶、竹子、水按照 3：7：100 的比例混合，置于锥形瓶中，沸水浴45min，每隔10min摇一次，过滤后冷却备用。将洗净的糯米加水浸泡120 min，沥干后蒸15～20min，至饭粒内无白芯，松软透明。待蒸好的糯米冷却后，按照酒曲、糯米、竹茶提取液1：50：100的比例混合均匀，加盖后于28℃恒温培养箱中发酵7d。将醪液在85℃下灭菌15min，过滤、冷却后即得到竹茶酒。

1.3.2 动物实验分组和设计

雄性ICR小鼠（清洁级）60只，置于标准鼠饲养笼里，每日光照12h，环境温度25℃，每日添加饲料和水，并更换垫料。

实验开始前，对小鼠进行1周的适应性喂养并观察以确认健康。将适应环境后的小鼠随机分成6组，每组10只，分别为：正常对照组、阳性对照组、衰老模型组、竹茶酒低剂量组、竹茶酒中剂量组、竹茶酒高剂量组。除正常对照组每日腹腔注射0.9%的生理盐水外，其余各组小鼠每日腹腔注射D-半乳糖300mg/(kg·d)，持续6周。正常对照组、衰老模型组每日灌胃0.9%生理盐水8mL/(kg·d)；竹茶酒低剂量组、中剂量组、高剂量组每日分别灌胃 4mL/(kg·d)、8mL/(kg·d)，16mL/(kg·d)竹茶酒；阳性对照组灌胃 10mg/(kg·d)维生素C溶液。连续灌胃6周后，摘眼球取血，将取血后的小鼠处死，解剖并摘取脾脏和肝脏。取出的脾脏和肝脏用0.9%的生理盐水冲洗，洗净表面残留血液，用滤纸吸干后称重。

1.3.3 血清、肝脏匀浆的制备

血清的制备：对小鼠摘眼球取得的血液，在3000r/min下离心15min得血清，4℃保存待用。

肝脏匀浆的制备：将用生理盐水洗净并用滤纸吸干的肝脏剪碎，精确称重，放入玻璃匀浆器中，加入9倍体积的生理盐水进行匀浆。

1.3.4 检测指标

（1）小鼠血清、肝脏组织中丙二醛（MDA）含量、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性的测定均按照试剂盒中的说明书进行操作。

（2）肝脏组织中的蛋白质含量根据考马斯亮蓝法进行测定。

（3）脏器指数的计算公式：

1.3.5 统计分析

所测得结果均用平均值±标准差表示。数据均采用SPSSV19.0完成统计处理，组间差异性采用t检验，以P<0.05为统计学显著意义。

2 结果与分析

2.1 竹茶酒对小鼠脏器指数的影响

采用竹茶酒灌胃D-半乳糖衰老模型小鼠，6周后测定小鼠脏器指数，结果如表1所示。正常对照组与阳性对照组的肝脏指数存在显著性差异（P<0.05），与衰老模型组、竹茶酒高中低剂量组之间无显著差异；阳性对照组与衰老模型组、竹茶酒高中低剂量组之间无显著差异。在脾脏指数中，竹茶酒低剂量组、中剂量组之间存在显著差异，而竹茶酒低剂量组与正常对照组、衰老模型组、阳性对照组、竹茶酒高剂量组之间无显著差异；竹茶酒中剂量组与正常对照组、衰老模型组、阳性对照组、竹茶酒高剂量组之间无显著差异。

表1竹茶酒对小鼠脏器指数的影响

2.2 竹茶酒对小鼠肝脏组织中MDA含量及TSOD、GSH-Px活性的影响

采用竹茶酒灌胃D-半乳糖衰老模型小鼠，6周后测定小鼠肝脏组织中MDA含量及T-SOD、GSH-Px活性，结果如表2所示。与衰老模型组相比，各组均能显著降低肝脏组织中的丙二醛含量（P<0.05），表明维生素C（阳性对照组）、高中低三个剂量的竹茶酒均能抑制MDA的产生。正常对照组与阳性对照组、竹茶酒中低剂量组之间无显著差异。MDA的含量随着竹茶酒灌胃剂量的增加而降低，其中高低剂量组之间的MDA含量差异达到显著水平。与正常对照组相比，竹茶酒高剂量组MDA含量显著降低，降低率达到35.4%。与衰老模型组相比，除了阳性对照组外，其他各组均能显著提高肝脏中SOD的活性。正常对照组与竹茶酒低剂量组之间无显著性差异，但竹茶酒高、中剂量组SOD活性与正常对照组相比显著提高，提高率达15.9%、25.8%。对于GSH-Px活性的提高，与衰老模型组相比，其他各组均有显著性的效果，表明维生素C、高中低剂量的竹茶酒均能显著提高肝脏中GSH-Px的活性。正常对照组与阳性对照组以及高低剂量组之间无显著差异，而竹茶酒中剂量组相较于正常对照组GSH-Px活性显著提高，提高率为11.7%。可以看出，竹茶酒高中低剂量组均能显著提高衰老模型小鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px的活性，并显著降低MDA的含量，而维生素C只能显著降低MDA含量以及提高GSH-Px活性。

表2 小鼠肝脏组织中MDA含量及T-SOD、GSH-Px活性

2.3 竹茶酒对小鼠血清中MDA含量及T-SOD、GSH-Px活性的影响

采用竹茶酒灌胃D-半乳糖衰老模型小鼠，6周后测定小鼠血清中MDA含量及T-SOD、GSH-Px活性，结果如表3所示。与衰老模型组相比，除了竹茶酒低剂量组外，其他各组均能显著性的降低血清中MDA的含量，阳性对照组与高中剂量的竹茶酒效果无显著差异。与正常对照组相比，竹茶酒中剂量组MDA含量显著降低，降低率达到19.4%。与衰老模型组相比，除了阳性对照组外，其他各组血清中SOD的活性均能显著提高，表明高中低剂量的竹茶酒均对提高SOD活性有显著效果。正常对照组与竹茶酒高中低剂量组无显著性差异。随着竹茶酒剂量的增加，SOD的活性不断增加，但无统计学意义。而对于GSH-Px活性的提高，与衰老模型组相比，其他各组均有显著效果。正常对照组与阳性对照组、竹茶酒低中剂量组之间无显著差异，高剂量组较正常对照组GSH-Px活性显著提高，提高率为9.7%。结果表明，高中低剂量的竹茶酒均能显著提高衰老模型小鼠血清中SOD、GSH-Px的活性，维生素C只能提高GSH-Px活性；而高中剂量的竹茶酒和维生素C(阳性对照组)均能显著降低MDA的含量。

表3 小鼠血清中MDA含量及T-SOD、GSH-Px活性

3 讨论

机体代谢过程中会产生氧自由基（包括·O2-、·OH 、1O2、H2O2），生理正常情况下，能够被体内的抗氧化酶（如SOD、GSH-Px等）或抗氧化剂迅速清除，使体内自由基的产生和清除处于平衡状态，一般不会对细胞产生损伤作用。随着年龄的增长，机体内抗氧化酶的活性会下降，使体内清除自由基的能力下降，以至大量具有高度化学活性的氧自由基与机体内DNA、蛋白质、氨基酸、脂质等发生过氧化变性、交联或断裂等反应[3-4]。当氧自由基与生物膜中的不饱和脂肪酸发生过氧化反应时，生物膜的结构和功能被破坏，从而引起细胞的衰老和死亡。脂质氧化的最终产物丙二醛（MDA）还可与蛋白质、氨基酸等大分子物质发生交联作用，交联聚合物（脂褐素）不溶于水，会在脑、肝、肾、心肌、骨骼肌、肾上腺、皮肤等部位的细胞内大量堆积，最终导致细胞代谢紊乱，从而加速机体的衰老进程[5]。

衰老模型的建立是评价抗衰老药物以及研究抗衰老机制的关键。衰老动物模型主要有D-半乳糖所致衰老模型、SAMP小鼠衰老模型、臭氧损伤衰老模型、去胸腺衰老模型、自然衰老模型等[6]。其中D-半乳糖所致亚急性衰老模型因为其操作简便、成本低廉、结果稳定等特点，被大量学者运用。在一段时间内，连续对动物进行皮下注射或腹腔注射大量的D-半乳糖，而D-半乳糖在还原酶作用下生成的半乳糖醇不能被细胞代谢，而沉积在细胞内，会增大细胞渗透压，破坏细胞的正常代谢，最终导致衰老的发生[7-8]。

本试验连续42d对小鼠腹腔注射300mg/(kg·d)的D-半乳糖，由实验结果可知，衰老模型组的小鼠血清及肝脏中SOD、GSH-Px的活性明显高于正常对照组，而MDA的含量明显低于正常对照组，说明本实验建模成功。本研究结果表明，竹茶酒能降低衰老小鼠肝脏、血清中MDA的含量，提高SOD、GSH-Px的活性，说明竹茶酒可提高自由基的清除率，减少自由基对机体产生的损伤，具有抗衰老作用。

［1］邬龄盛，叶乃兴，王振康.浅析茶类酒生产的现状及展望[J].茶叶科学技术，2005（1）：27-28.

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［8］许扬，吴涛，顾佳黎，等.D-半乳糖诱导衰老动物模型研究进展［J］.中国老年学杂志，2009（29）：1710-1712.