pH 值对纤维素酶在麦草碱木质素上吸附的影响*

楼宏铭 李秀丽 王梦霞 邱学青† 杨东杰 邓永红

(1.华南理工大学 化学与化工学院，广东 广州 510640;2.华南理工大学 制浆造纸工程国家重点实验室，广东 广州 510640)

随着资源和环境问题的日益严重，越来越多的人将注意力集中在清洁能源的开发上.地球上每年植物光合作用的生物量可达2000 亿吨，其中大部分为木质纤维素类.由于其可再生性和广泛性，木质纤维素受到越来越多学者的关注［1］.木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素三大部分组成，其中含量占到65%～75%的纤维素和半纤维素可以酶解而生成可发酵糖，进而发酵得到乙醇［2］.

木质纤维素的酶解是一个非常复杂的过程，受到很多因素的影响.首先，木质纤维素的顽抗性是影响其高效酶解的重要因素之一，因此目前很多研究都是将木质纤维素进行物理或化学预处理，期望将木质纤维素的三大组成部分分离开或是尽量降低木质素的含量［3］，从而促进纤维素酶在纤维素上的吸附，提高酶解效率，并减少酶的用量，降低生产成本［4］.其次，木质素对木质纤维素的酶解过程有一定的阻碍作用，主要体现在两个方面:空间位阻效应以及对纤维素酶的无效吸附［5］.由于通过预处理去除木质素来消除木质素对纤维素酶解过程带来的空间位阻效应的经济成本很高［3］，且木质素的完全去除是不太可能的.纤维素酶在木质素上的无效吸附不可避免，因此可行的办法是减少纤维素酶在木质素上的吸附.

减少纤维素酶在木质素上的吸附的方法有很多种，如添加表面活性剂、蛋白质和聚合物等.但是由于这些化学试剂成本较高，在大规模的工业生产应用中受到一定的限制.也有很多的学者将注意力集中于提高纤维素酶的回收利用，以降低木质纤维素的酶解成本.有学者通过在酶解液中加入Span 80、Tween 80 和Tween 20 等来提高纤维素酶的回收率或加入新鲜的木质纤维素来吸附并回收纤维素酶［9-10］.同时，超滤法也被用于纤维素酶的回收利用［11］，该方法几乎可以回收全部游离的纤维素酶.但是以上方法都需要投入较高的成本.

石英晶体微天平(QCM-D)已被用于研究纤维素酶、蛋白质等在木质纤维素薄膜和纤维素薄膜上的吸附［6-9］.文中通过QCM-D 研究不同pH 值下纤维素酶在木质素薄膜上的吸附和脱附情况.

1 实验方法

1.1 主要试剂

醋酸钠缓冲液的离子强度为50 mmol/L，pH 值分别为4.8、5.5、6.0;麦草碱木质素经过碱溶(pH=12)后超滤，再酸析(pH=2)水洗得到相对分子质量大于30000 的产品;实验所用纤维素酶(CTec2)是木霉属工业用纤维素酶，由诺维信公司提供，根据文献［12］中的方法测得的酶活为147FPU/g glucan，蛋白质含量为73.6 g/L.实验中所用的CTec2 溶液的酶蛋白含量为100 mg/L.

1.2 麦草碱木质素薄膜的制备

采用旋涂法制备麦草碱木质素薄膜.旋涂仪型号为WS-400Bz-6NPP-LITE (迈可诺公司，中国).首先用0.75 mol/L 的氨水溶液溶解麦草碱木质素［13］，并搅拌24 h，10 000 r/min 离心5 min，得到质量分数为2%的麦草碱木质素溶液.旋涂仪设置的转速为2000 r/min，旋涂时间为60 s.

1.3 Zeta 电位测定

将pH=4.8、5.5、6.0 的CTec2 溶液分别注入电泳池中，测定Zeta 电位，残差保持在0.05 以下，测定4 次取均值.

1.4 QCM-D 分析

实验采用金片，使用前用氨水(25%)、过氧化氢(30%)和纯水质量比为1∶1∶5 的混合液在75 ℃下处理5 min.QCM-D(Q-Sense 501 型，瑞典)为单通道流通池，蠕动泵流率控制在0.100 mL/min.

晶体石英微天平可以感测到十分微小的质量变化，它测得的质量和频率的变化成反比，耗散因子(D)与薄膜的刚柔性成正比，也就是说，耗散因子越大，薄膜的柔性就越大，吸附薄膜就越疏松.由于第三倍频的稳定性，实验所采用的数据均为第三倍频的数据.

实验过程中，先用不同pH 值的醋酸钠缓冲液进行吸附试验(基线)，而且必须在吸附平衡后才能进样.等待吸附平稳后，用纤维素酶溶液进行吸附测试.纤维素酶的吸附实验采用静态吸附模式，也就是当QCM-D 的流通池内充满CTec2 溶液后停止蠕动泵.而脱附实验采用的是动态模式，也就是实验过程中一直保持蠕动泵的运转状态.

1.5 原子力显微镜(AFM)分析

测试仪器为韩国PARK 公司生产的XE-100 型原子力显微镜.选用NCHR 探针，设置扫描分辨率为512 ×512 像素，扫描频率为1Hz，设置扫描模式为非接触模式，扫描得麦草碱木质素薄膜的表面形貌.测试的温度设置为25 ℃.

2 结果与讨论

2.1 麦草碱木质素薄膜的稳定性

CTec2 在麦草碱木质素薄膜上的吸附实验必须在缓冲液吸附(基线)达到平衡以后才能进行，所以，必须保证制得的麦草碱木质素薄膜的稳定性.图1(a)所示是醋酸钠缓冲液吸附的阶段，从图中可以看出，吸附量(-ΔF3)和耗散因子(ΔD3)在300 s 以后几乎没有发生变化，说明麦草碱木质素薄膜没有发生脱附现象，并且图中显示两次实验具良好的重复性，再次说明所制得的麦草碱木质素薄膜稳定.而缓冲液吸附的过程(如图1(b)所示)可以分为3 个阶段:(1)ΔF3和ΔD3接近于零，在这个阶段，引起ΔF3和ΔD3变化的是管路中的空气在木质素薄膜上的吸附;(2)缓冲液进入流通池，与麦草碱木质素发生接触，使麦草碱木质素薄膜发生快速溶胀，所以ΔF3和ΔD3的变化都很大;(3)醋酸钠缓冲液充满整个流通池，麦草碱木质素薄膜充分溶胀，以至于ΔF3和ΔD3的变化很小，说明此时木质素薄膜已达到稳定的溶胀状态.

原子力显微镜扫描图(图1(c))显示，在用缓冲液吸附前后，麦草碱木质素薄膜的表面粗糙度分别为0.894 和0.842 nm.从麦草碱木质素的表面形貌以及粗糙度的变化来看，麦草碱木质素薄膜在实验过程中表现出很好的稳定性，从而保证了实验的顺利进行.

2.2 纤维素酶在麦草碱木质素上的吸附形态

为了研究CTec2 在麦草碱木质素薄膜上的吸附形态，在缓冲液的吸附达到平衡后，测定CTec2 在麦草碱木质素薄膜上吸附和脱附时ΔF3和ΔD3的变化，如图2 所示.其中，CTec2 溶液用pH =5.5、离子强度为50 mmol/L 的醋酸钠缓冲液配制.从图中可以看出，CTec2 在麦草碱木质素上的吸附阶段，耗散因子(ΔD3)随CTec2 的吸附量(-ΔF3)的增大而增大，说明麦草碱木质素薄膜在吸附上CTec2 后，膜的柔性或者厚度明显增大，当CTec2 的吸附达到平衡后，ΔF3和ΔD3不再发生变化.从CTec2 在麦草碱木质素薄膜上的脱附过程来看，ΔD3随ΔF3的变化更加明显，但是在脱附完成时，ΔF3并没有达到CTec2的脱附初始值，说明CTec2 并没有完全脱附，也就是说吸附在麦草碱木质素薄膜上的CTec2 有可逆吸附和不可逆吸附之分.所以，从纤维素回收的角度来看，增大纤维素酶在木质素上的可逆吸附有利于提高纤维素酶的回收率，降低木质纤维素的酶解成本.

图1 醋酸钠缓冲液(pH =4.8，离子强度为50 mmol/L)吸附平衡后，麦草碱木质素薄膜的变化Fig.1 Film change of wheat straw alkaline lignin after the adsorption equilibrium in sodium acetate solution with a pH value of 4.8 and an ionic strength of 50 mmol/L

图2 CTec2 在麦草碱木质素薄膜上的吸附引起的ΔF3和ΔD3的变化Fig.2 Change of ΔF3and ΔD3 induced by the adsorption of CTec2 on wheat straw alkaline lignin film

2.3 pH 值对纤维素酶在麦草碱木质素薄膜上吸附的影响

用Zeta 电位测得CTec2 的等电点pI 值为4.37，所以在pH =4.8，5.5，6.0 时，CTec2 会带负电，且pH 值越高，CTec2 所带的负电荷越多.而木质素在所讨论的pH 值下也是带负电的.实验测得pH =4.8，5.5，6.0 时，CTec2 的蛋白含量为100 mg/L 时的Zeta 电位分别为(-5.85 ±0.23)、(-8.26 ±0.34)、(-10.47 ±0.30)mV.所以，在pH =4.8 时CTec2 与木质素之间存在静电斥力，在pH =5.5 以及更高的pH 值时CTec2 与木质素之间存在的静电斥力更大.因此，在较低的pH 值下，CTec2 在麦草碱木质素上的吸附量较大，如图3(a)所示.

如图3(b)所示，不同的pH 值下，CTec2 在木质素上吸附的ΔF3、ΔD3关系图的斜率有很大的不同，pH 值越高斜率越大.ΔD3-ΔF3曲线的斜率通常用来表征吸附膜的粘弹性，这与吸附的分子的结构以及构象有密切的联系.pH 值越高，CTec2 与木质素之间的静电斥力越大，也就使得CTec2 在麦草碱木质素表面形成的吸附膜越疏松，从而表现出更大的粘弹性.图3(b)结果表明，当纤维素酶的量一定时，减少纤维素酶在木质素上的吸附可以增大其在纤维素上的吸附量，从而提高木质素纤维素的酶解效率.Lou 等［14-15］的研究发现，在较高的pH 值下，木质纤维素的酶解效率明显提高，原因可能是因为较高的pH 值下纤维素酶在木质素上的吸附减少，而本实验结果恰好证实了这一点.

图3 pH 值为4.8、5.5 和6.0 时CTec2 在麦草碱木质素薄膜上的吸附Fig.3 Adsorption of CTec2 on wheat straw alkaline lignin film at the pH values of 4.8、5.5 and 6.0

2.4 pH 值对纤维素酶在麦草碱木质素薄膜上脱附的影响

离子强度为50 mmol/L 时，pH 值对CTec2 在麦草碱木质素薄膜上的脱附的影响如表1 所示.从表1 中可以看出，在相同的pH 值下吸附后再用不同pH 值的醋酸钠缓冲液进行脱附，脱附pH 值越高，CTec2 的脱附量越大，CTec2 的可逆吸附部分占全部吸附量的比例也越大.因为在较高的pH 值下，CTec2 与麦草碱木质素之间的静电斥力较大，而且CTec2 在麦草碱木质素上形成的吸附膜更为疏松，粘弹性更大，所以使得CTec2 更容易从麦草碱木质素薄膜上脱附下来.因此，可利用纤维素酶在较高的pH 值下较易脱附的特点来回收纤维素酶，增大纤维素酶的利用率，并降低成本.

表1 离子强度为50 mmol/L 时，pH 值对CTec2 在麦草碱木质素薄膜上脱附的影响Table 1 Effect of pH value on the desorption of CTec2 on wheat straw alkaline lignin when the ionic strength of buffer is 50 mmol/L

3 结论

用旋涂法制得的麦草碱木质素薄膜平滑而且稳定性很好，可用于研究CTec2 在麦草碱木质素薄膜上的吸附和脱附情况.纤维素酶在麦草碱木质素上的吸附存在可逆吸附和不可逆吸附之分.在较高的pH 值下，纤维素酶与麦草碱木质素之间的静电斥力较大，形成的吸附膜较为疏松，纤维素酶在麦草碱木质素薄膜上的吸附量较少，有利于提高木质纤维素的酶解效率.同时，较高的pH 值下，纤维素酶在麦草碱木质素薄膜上的吸附变得不牢固，可逆吸附部分的纤维素酶增多，从而会有更多的纤维素酶从麦草木质素薄膜上脱附下来，提高纤维素的回收利用率.

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